Mechanismy působení podjednotek (structure maintenance of chromosome) komplexů SMC5/6

Mgr. Marek Adamus, Ph.D.

Doctoral thesis

Mechanisms of action of the SMC5/6 (structure maintenance of chromosome) subunits

Abstract:

Údržba chromozomů, jejich oprava a replikace jsou náročné úkoly vyžadující robustní mašinérii proteinových komplexů. Rodina komplexů „Structural Maintenance of Chromosome” (SMC) má nezastupitelnou roli v různých aspektech údržby genomu, včetně opravy DNA, její replikace, kondenzace a segregace. Doposud byly popsány tři eukaryotické (kohezin, kondenzin a SMC5/6) a tři prokaryotické (SMC/ScpAB, MukBEF, MksBEF) komplexy SMC, které se skládají ze dvou dlouhých proteinů SMC schopných vázat DNA, a z takzvaných podjednotek „Non-SMC Elements“ (NSE), které moderují jejich vlastnosti. Bylo zjištěno, že si jsou podjednotky NSE prokaryotických komplexů SMC a eukaryotického komplexu SMC5/6 strukturně podobné. Skládají se z domén „Winged-Helix“ (WH), které vytvářejí stabilní homo- nebo hetero-dimery a interagují s „kleisinovou“ podjednotkou NSE přemosťující dva proteiny SMC. Tato dizertační práce obsahuje přehled vlastností komplexů SMC se zaměřením na jejich strukturální podobnost a na protein-proteinové interakce, které tvoří základ těchto komplexů, se zvláštním důrazem na komplex SMC5/6. Experimentální část se skládá ze tří odborných publikací, které se věnují architektuře komplexu SMC5/6 a interakcím a mechanismům působení jeho proteinových podjednotek. Analýzou lidského pentameru SMC5-SMC6-NSE1-NSE3-NSE4 pomocí chemického zesíťování a následnou detekcí pomocí tandemové hmotnostní spektrometrie, spolu s využitím elektronové mikroskopie, jsme zjistili, že je tento komplex schopen zaujmout jak kruhové, tak i vzpřímené konformace, a preferenčně váže jednovláknovou DNA. Provedené síťování odhalilo místa s vyšším výskytem přemostěných aminokyselin podél „coiled-coil“ ramen (tzv. hot-spots), která zřejmě slouží jako primární interakční povrch mezi dvěma rameny jednotlivých proteinů SMC. To naznačuje, že interakce mezi rameny není stejnoměrná podél celého interakčního rozhraní. Dále jsme určili polohu lidského trimeru NSE1-NSE3-NSE4 poblíž takzvaného „krku“ podjednotky SMC6 a popsali jeho vazebnou preferenci vůči dvouvláknové DNA. Na tomto základě jsme zkoumali mechanismus interakce „helix-turn-helix“ domény „kleisin“ podjednotky NSE4 s krkem podjednotky SMC6, což představuje jeden z regulačních kroků v rámci ATPázového cyklu komplexu SMC5/6, jenž je negativně regulován podjednotkami NSE1 a NSE3. Rovněž jsme prozkoumali interakci mezi lidskými podjednotkami SMC a proteinovým dimerem NSE5-NSE6, a objasnili jsme význam strukturně konzervované domény „Coiled-coil and Nse Interacting“ (CANIN) podjednotky NSE6. Shrnuto, dokázali jsme popsat a vyjasnit strukturní vlastnosti lidského komplexu SMC5/6 a obzvláště mechanismy působení jeho podjednotek NSE, u kterých jsme odhalili novou regulační funkci.

Abstract:

Chromosome safekeeping, maintenance, and replication is a challenging task that requires a robust machinery of protein complexes. A family of conserved Structural Maintenance of Chromosome (SMC) complexes plays important role in various aspects of genome maintenance, including DNA repair, replication, condensation, and segregation. So far, three eukaryotic (cohesin, condensin, and SMC5/6) and three prokaryotic (SMC/ScpAB, MukBEF, MksBEF) SMC complexes have been described. They consist of two long SMC proteins capable to embrace and hold DNA. In addition, there are several Non-SMC Elements (NSE), which regulate and enhance properties of the SMC proteins. It was shown that the prokaryotic SMCs and the eukaryotic SMC5/6 complex’s NSE subunits share structural similarities. These NSE subunits are composed of winged-helix (WH) domains which form stable homo- or hetero-dimers and interact with a kleisin NSE subunit that bridges two SMC proteins. This thesis provides an overview of the SMC complexes and focuses on their structural properties and protein-protein interactions that form the complexes, with an emphasis on the SMC5/6 complex. The experimental part consists of three research articles that focus on the SMC5/6 complex, its architecture, and interactions and mechanisms of action of its subunits. We purified and analysed the human pentameric SMC5-SMC6-NSE1-NSE3-NSE4 complex by crosslinking and MS/MS analysis, and by electron microscopy. We found out that the SMC5/6 adopts both rod-like and ring-like conformations and prefers ssDNA. Also, we discovered frequently crosslinked hot spots along the coiled-coil arms that likely serve as interaction sites, suggesting that the interaction between the arms is not uniform all along the coiled-coil interface. In addition, we specified position of the NSE1-NSE3-NSE4 trimer close to the SMC6 neck and described its dsDNA binding properties. We investigated mechanism of the kleisin NSE4 subunit HTH domain interaction with the SMC6 neck that serves as a regulatory step in the ATPase cycle and is negatively regulated by NSE1 and NSE3 subunits. Finally, we clarified interaction between the human SMC proteins and NSE5 and NSE6, and revealed importance of structurally conserved NSE6 Coiled-coil and Nse Interacting (CANIN) domain. Taken together, we managed to describe and clarify structural properties of the human SMC5/6 complex, as well as of the NSE subunits, and we revealed their novel regulatory functions and mechanisms of action.

Keywords

SMC5/6 komplex, SMC, NSE podjednotky, NSE5, NSE6, CANIN, DNA vazba, chemický krosslink, DSBU, ATPasa, SMC5/6 complex, NSE subunits, DNA binding, chemical crosslinks, ATPase

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 6. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 20. 8. 2020
• Supervisor: doc. Mgr. Jan Paleček, Dr. rer. nat.
• Reader: doc. Mag. Dr. Juraj Gregáň, doc. Mgr. Aleš Pečinka, Ph.D., prof. Stephen Gruber, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Life Sciences / Bio-omics