Expression of detoxification enzymes and genes involved in the processes of apoptosis, DNA repair and proliferation in vitro

Mgr. Eva Hrubá, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Z výčtu všech funkcí připisovaných aryluhlovodíkovému receptoru (AhR), který je ligandem aktivovaným transkripčním faktorem, hraje klíčovou roli jeho úloha v biotransformaci prokarcinogenů na reaktivní metabolity s potenciálem karcinogenního/genotoxického působení. Kromě tradičně vymezené role v klasické dráze metabolické aktivace xenobiotik ale AhR moduluje také celou řadu zásadních buněčných signálních drah. Působení ligandů Ah receptoru je spojováno s narušením průběhu intracelulární signalizace, což může mít nejrůznější toxické a karcinogenní důsledky. Genotoxické efekty konkrétních AhR ligandů jsou primárně spojovány s jejich metabolickou aktivací, nicméně schopnost totožných ligandů zároveň spouštět i signální dráhu Ah receptoru, může přispívat k dalšímu škodlivému působení nad rámec přímého poškození DNA. Pro genotoxické ligandy AhR jsou oba jevy neoddělitelné a každý z nich se do určité míry podílí na celkovém výsledném dopadu těchto látek na rozvoj rakovinného bujení a pravděpodobně také na přirozené vývojové a fyziologické procesy. Jedním ze způsobů, jak studovat provázanost genotoxictya zprostředkované aktivity AhR, je současné testování genotoxického a negenotoxického AhR ligandu v jednom experimentálním modelu za stejných podmínek a porovnání jejich efektů. Tento zjednodušující přístup ale nemusí vést k uspokojujícím a přesvědčivým závěrům vzhledem k narůstajícímu počtu pozorování poukazujících na rozmanitost biologie AhR, ke kterému jistě přispívá i existence interakce AhR s různými signálními drahami, nedávno popsaná negenomová signalizace AhR nebo jeho efekty nezávislé na aktivaci ligandem. Naší motivací provést experimenty diskutované v této dizertační práci byla snaha přispět k interpretaci výše popsaných AhR zprostředkovaných efektů vybraných aromatických kontaminantů. Co se týče poškození DNA jako přímého důsledku ativace AhR, bylo studováno působení dibenzokarbazolů a geonotoxických polycyklických aromatických uhlovodíků (PAU). Při testování 7H-dibenzo[c,g]karbazolu a jeho syntetického hepatokarcinogenního a sarkomagenního methylovaného derivátu na lidských keratinocytech a jaterním buněčném modelu, jsme se zaměřili na inducibilitu jednotlivých isoforem enzymů rodiny cytochromu P450, o níž se ve spojitosti těchto látek s lidskými buněčnými liniemi odvozenými od jejich responsivní tkáně příliš neví. Výsledky studie přinesly potvrzení schopnosti dibenzokarbazolů indukovat enzymy CYP1 a způsobovat genotoxické efekty díky tvorbě jejich reaktivních metabolitů v příslušných testovaných buněčných modelech. Tato zjištění byla společně se stanoveným výsledným typem genotoxického poškození DNA dále diskutována s ohledem na tkáňově specifické karcinogenní účinky dibenzokarabolů. Epidemiologické studie naznačují možnou souvislost rozvoje rakoviny prostaty se stravovacími návyky a profesní expozicí PAU, proto jsme se dále zaměřili na stanovení vzniku DNA aduktů po aplikaci dibenzo[a,l]pyrenu a benzo[a]pyrenu (BaP) na lidské prostatické rakovinné buňky a důsledky vzniku tohoto poškození. Je zajímavé, že i přes signifikantní tvorbu aduktů, genotoxické PAU nevyvolaly v použitém experimentálním modelu apoptózu, zástavu buněčného cyklu a buněčnou odpověď na poškození DNA závislou na aktivaci proteinu p53. Tato skutečnost naznačuje, že efekty PAU v karcinomu prostaty mohou být z velké části připisovány jejich schopnosti aktivovat AhR. Abychom tuto hypotézu ověřili, ve stejném buněčném modelu jsme provedli microarray analýzu změň genové exprese po použití modelového genotoxického (BaP) a negenotoxického (tetrachlórdibenzo-p-dioxin, TCDD) AhR ligandu. Jak se ukázalo, vliv obou

Anotace:

látek na regulaci genové exprese byl velmi podobný. Pokusili jsme se tedy vyvodit závěry, jak může genotoxický BaP přispívat k případnému rozvoji rakoviny prostaty právě na základě jeho schopnosti regulovat genovou expresi v prostatických buňkách. Kromě výše popsaných pokusů jsme se zaměřili i na studium funkce AhR v interakci se signálními drahami zapojenými do vývoje prostaty a její tumorigeneze. Konkrétně na crosstalk mezi TCDD a transformujícím růstovým faktorem β1 (TGF-β1) v buněčné linii odvozené z tkáně benigní prostatické hyperlplazie. Naše výsledky naznačují, že signální dráha TGF-β1 má v kontextu prostatické tkáně v tomto crosstalku se signální drahou AhR vedoucí postavení.

Abstract:

Above all aryl hydrocarbon receptor (AhR) functions, this ligand-activated transcription factor is a key regulator of xenobiotic metabolism, the process comprising of the biotransformation of procarcinogens to reactive intermediates with carcinogenic/genotoxic potential. Besides the well-characterized role of AhR in the classical route of metabolism of xenobiotics, AhR also acts as a modulator of a variety of critical cellular signaling pathways. Xenobiotic AhR ligands may be intrinsically connected with the perturbation of these pathways, resulting in a wide range of toxic and carcinogenic responses. Metabolic activation of particular AhR ligands is primarily related to their genotoxic effects, while the ability of the same ligands to trigger AhR signaling may be involved in additional deleterious effects beyond direct DNA damage. In case of exposure to genotoxic AhR ligands, both events are inseparable and each seems to contribute to a certain extent to the overall final impact on the development of cancer and most likely also on the normal developmental and physiological processes. An insight into complex relationship of genotoxicity and AhR-mediated activity can be provided by an employment of both genotoxic and non-genotoxic AhR ligands and comparison of their effects in the same experimental model. Nevertheless, this simple approach can meet with limited success, because of a growing body of evidence showing interestingly diverse features of AhR biology, including crosstalks with other signaling pathways, recently described nongenomic signaling or ligand-independent activities. Within the scope of the dissertation presented herein, set of experiments was performed in order to contribute to understanding of above described AhR-mediated effects of selected model environmental pollutants. Regarding AhR activation-dependent DNA damage, effects of dibenzocarbazoles and genotoxic PAHs were examined. 7H-dibenzo[c,g]carbazole (DBC) and its synthetic hepatocarcinogenic and sarcomagenic methyl derivatives, which manifest a specific tropism to corresponding responsive organs, were tested in human keratinocytes and hepatoma cell line paying attention to inducibility of the individual enzyme isoforms of cytochrome P450 family 1 (CYP1), an information missing in specific human target cells for these compounds. Our results confirmed the capacity of particular dibenzocarbazoles to induce CYP1 enzymes and exert the genotoxic effects via their reactive metabolites in the cell models of human skin and liver tissue. Nature of DNA damage underlying this genotoxicity was characterized and discussed, together with observed metabolic capacity of the cell lines tested, with respect to tissue-specific carcinogenic properties of these compounds. Differences between tissues in the AhR-dependent expression of drug-metabolizing enzymes may greatly contribute to the tissue-specificity and dictinct molecular mechanisms and biological activity of chemical carcinogens, even with remarkable structural similarity. Since epidemiologic studies support a possible link between diet and occupational exposure to PAHs and the risk of prostate cancer, DNA adduct formation and its consequences induced by dibenzo[a,l]pyrene (DBalP) and benzo[a]pyrene (BaP) were investigated in human prostate carcinoma cells. Although the genotoxic PAHs produced significant levels of DNA adducts, they failed to induce the p53-dependent DNA damage response, apoptosis or cell-cycle arrest in our cell model. The findings of the study indicated that effects of PAHs in prostate carcinoma might be largely due to its AhR-mediated activity. In order to further examine this hypothesis, we performed microarray analysis on gene expression in the same model of prostate carcinoma cells exposed to BaP and 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (TCDD) to compare gene expression changes induced by model genotoxic and non-genotoxic AhR ligand. Gene expression changes induced by both compounds turned out

Abstract:

to be similar to a large extent and they were AhR-dependent. Based on the data obtained, we suggested how modulation of gene expression in prostate carcinoma cell line by BaP might potentially contribute to the prostate cancer development. Regarding AhR interactions with the signaling pathways involved in prostate development and tumorigenesis, we focused on the crosstalk between TCDD and transforming growth factor-β1 (TGF-β1) in cell line derived from the benign prostatic hyperplasia. Our results suggest that TGF-β1 signaling plays a dominant role in the crosstalk with AhR signaling pathway in the prostate-specific context.

Keywords

Dibenzo[c, g]carbazoles, Benzo[a]pyrene, 2, 3, 7, 8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin, DNA adducts, Genotoxicity, DNA damage response, Apoptosis, Cell cycle, Global gene expression, Aryl hydrocarbon receptor, AhR crosstalk, TGF-β1 signaling, Tissue-specificity in carcinogenesis, Prostate carcinogenesis

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 22. 4. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 10. 6. 2013
• Vedoucí: RNDr. Miroslav Machala, CSc.
• Oponent: prof. RNDr. Zdeněk Dvořák, DrSc. et PhD., prof. RNDr. Lenka Skálová, PhD.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie (čtyřleté) / Biochemie