Metody měření parametrů oxidačního stresu u hmyzu

Mgr. Eliška PINĎÁKOVÁ

Master's thesis

Methods of measurement of oxidative stress in insects

Abstract:

Reaktivní kyslíkové radikály neboli ROS jsou velmi reaktivní molekuly kyslíku s oxidačními vlastnostmi. Tyto molekuly vznikají během metabolismu v buňce, nebo pochází z exogenních zdrojů (ionizující záření, pesticidy, toxické látky). Množství ROS v buňce je regulováno antioxidačním systémem, jehož součástí je řada antioxidačních enzymů a látek. V nízké koncentraci hrají důležitou roli ve fyziologických procesech jako je signalizace či fagocytóza. K produkci ROS také dochází v rámci humorální imunitní reakce, jakožto reakce proti vnějším i vnitřním biologickým vlivům. Avšak ve vysoké koncentraci jsou ROS cytotoxické a poškozují řadu biologicky důležitých molekul. Jejich působením dochází například k peroxidaci lipidů, karbonylaci proteinů či oxidaci DNA; čímž tyto molekuly ztrácí svou funkci. Ke stanovení oxidačního stresu se využívá měření koncentrace koncových produktů oxidačního poškození. V experimentální části byly optimalizovány metody pro stanovení lipidické peroxidace (LPX). Metodou FOX2 byla stanovena koncentrace lipidových hydroperoxidů (LOOH). Byla optimalizována příprava vzorků s výslednou spektrofotometrickou detekcí a kvantifikací těchto látek na mikrodestičkovém readru. Byla ověřena správnost a opakovatelnost tohoto stanovení, a to jak u standardů pro LOOH, tak i u vzorků včel. Další optimalizovanou metodou byla metoda TBARS, kterou se stanovuje koncentrace jednoho z koncových produktů LPX - malondialdehydu (MDA). Bylo optimalizováno fluorescenční stanovení na mikrodestičkovém readru, které mělo vyšší citlivost, nežli UV-VIS stanovení MDA. Pro metodu TBARS byla optimalizována také HPLC separace, detekce a kvantifikace produktu MDA. Tyto tři způsoby stanovení byly srovnány, pro rutinní laboratorní analýzu se nejlépe hodí fluorescenční stanovení pomocí mikrodestičkového readru. Stanovení na mikrodestičkovém readru je ve srovnání s HPLC stanovením rychlejší a levnější. Po optimalizaci byly tyto metody využity ke stanovení lipidické peroxidace u včel, u nichž byl indukován oxidační stres, a to jak chemicky - paraquatem; tak vysokým napadením parazitem Varroa destructor. Metodou FOX2 byl u vzorků ošetřených paraquatem pozorován nárůst koncentrace LOOH se zvyšující se mírou stresu. Avšak u Varroa napadených včel koncentrace LOOH se zvyšující se mírou stresu klesala. Fluorescenčním stanovením metody TBARS byly stanoveny koncentrace MDA ve stejných vzorcích včel. U Varroa včel byla koncentrace MDA nižší, nežli u kontrolních (zdravých) včel, čímž se potvrdil trend stanovený FOX2 metodou. Koncentrace MDA byla u včel ošetřených paraquatem velmi nízká a trend zde nebyl prokázán.

Abstract:

Reactive oxygen species or ROS are highly reactive oxygen molecules with oxidizing properties. These molecules are formed during metabolism in the cell or come from exogenous sources (ionizing radiation, pesticides, toxic substances). The amount of ROS in a cell is regulated by an antioxidant system, which includes a number of antioxidant enzymes and substances. At low concentrations, they play an important role in physiological processes such as cell signaling or phagocytosis. ROS production also occurs as part of a humoral immune response, as a response against both external and internal biological influences. However, at high concentrations, ROS are cytotoxic and damage a number of biologically important molecules. For example, their action leads to lipid peroxidation, protein carbonylation or DNA oxidation; whereby these molecules lose their function. Measurement of the concentration of oxidative damage terminal products is used to determine oxidative stress. In the experimental part, methods for the determination of lipid peroxidation (LPX) were optimized. The concentration of lipid hydroperoxides (LOOH) was determined by the FOX2 method. The preparation of samples was optimized with the optimized spectrophotometric detection and quantification of these substances on a microplate reader. The accuracy and repeatability of this determination were verified, both for LOOH standards and for bee samples. Another optimized method was the TBARS method, which determines the concentration of one of the terminal products of LPX - malondialdehyde (MDA). The fluorescence assay on a microplate reader was optimized, it had a higher sensitivity than the UV-VIS assay. HPLC separation, detection and quantification of the MDA product were also optimized for the TBARS method. All the three assay methods were compared, with fluorescence assays using a microplate reader being best suited for routine laboratory analysis. The microplate reader assay is faster and cheaper than the HPLC assay. Optimized methods were used to determine lipid peroxidation in bees in which oxidative stress was induced, both chemically - by paraquat and by high infestation by the parasite Varroa destructor. An increase in LOOH levels with increasing stress was observed in paraquat-treated samples using the FOX2 method. However, in Varroa-infested bees, LOOH levels decreased with increasing stress. MDA concentrations in the same bee samples were determined by TBARS fluorescence assay. In Varroa bees, the MDA concentration was lower than in control (healthy) bees, thus confirming the trend determined by the FOX2 method. MDA levels were very low in paraquat-treated bees and the trend was not demonstrated.

Keywords

Včela medonosná, reaktivní formy kyslíku, oxidační stres, oxidační poškození, lipidická peroxidace, metoda TBARS, metoda FOX2, HPLC

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 26. 4. 2021

Thesis defence

• Date of defence: 24. 5. 2021
• Supervisor: Mgr. Jiří Danihlík, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry