Detekce vybraných markerů motility u spermií hřebců

Bc. Eliška Kotousová

Master's thesis

Detection of selected motility markers in stallion spermatozoa

Abstract:

Diplomová práce je zaměřena na hodnocení potencionální plodnosti u plemenných hřebců prostřednictvím proteomických přístupů, identifikující klíčové proteiny spojené s reprodukcí, které mohou sloužit jako potenciální markery plodnosti. Práce se zabývala studiem a porovnáním vybraných molekulových markerů u tří hřebců s ohledem na motilitu spermií. Důraz byl kladen především na hřebce 2 a hřebce 3, kteří byli opakovaně odebíráni v jednom období. Cílem bylo posoudit hladiny fosforylovaných proteinů a množství proteinu kotvícího proteinkinázu A (AKAP4), který je považován za marker plodnosti. Kromě toho byla provedena lokalizace a detekce sialových kyselin v glykoproteinech spermií jako terminálních sacharidů glykanů přítomných v glykokalyx spermií. Naše výsledky ukázaly přítomnost proteinu AKAP4 v hlavní části bičíku spermie u analyzovaných hřebců. Jeho množství ve spermiích mezi hřebci nebylo prokázáno jako statsticky významné. Lokalizace fosforylovaných proteinů na tyrosinu ukázala bodový signál v postakrozomální oblasti hlavičky spermie. Kromě toho byly detekovány dva fosfoproteiny o molekulové hmotnosti 37 kDa a 34 kDa, přičemž byla pozorována kolísavá míra fosforylace během sezón. Bylo zjištěno, že míra fosforylace proteinů se s prodlužující se dobou od prvního odběru v reprodukční sezóně snižuje. V případě fosfoproteinu o molekulové hmotnosti 37 kDa byla navíc zaznamenána rozdílná míra fosforylace mezi hřebcem 2 a 3. Vizualizace vazby sialových kyselin v glykoproteinech hřebčích spermií pomocí biotinylovaných lektinů WGA, MAL II a SNA odhalila rozdílné glykosylační vzory. Následně statistické analýzy denzitometrických dat zdůraznily významné rozdíly v sialylaci mezi hřebci. Dále bylo provedeno vyhodnocení celkové a progresivní motility, přičemž byl zaznamenán signifikantní rozdíl v motilitě mezi hřebci 1 a 2. Vzhledem k omezenému počtu odběrů u hřebce 1 nebylo možné proteomická data vyhodnotit. Přesto naše výsledky naznačují, že by změny v množství a modifikacích vybraných proteinů mohly do jisté míry v případě získání více experimentálních dat korelovat s motilitou spermií, a tím i s fertilizační schopností spermií hřebců. Nicméně nám nebyl umožněn odběr hřebčího spermatu v reprodukční sezóně a nebyla nám poskytnuta přesná data o fertilizační historii hřebců.

Abstract:

The thesis focuses on evaluating the potential fertility in breeding stallions through proteomic approaches, identifying key proteins associated with reproduction that could serve as potential fertility markers. The thesis involved the examination nad comparison of selected molecular markers in three stallions with regard to sperm motility. Emphasis was mainly focused on stallion 2 and 3, sampled repeatedly during one season. The aim was to assess the levels of phosphorylated proteins and the quantity of protein anchoring proteinkinase A (AKAP4), considered a fertility marker. Additionally the localization and detection of sialic acids in sperm glycoproteins as terminal carbohydrate residues present in the sperm glycocalyx were conducted. Our results revealed the presence of AKAP4 protein in the main part of sperm flagella in the analyzed stallions. However its quantity in sperm was not statistically significant among the stallions. Localization of tyrosine phosphorylated proteins showed a punctate signal in the post-acrosomal region of the sperm head. Moreover two phosphoproteins with molecular weights of 37 kDa and 34 kDa were detected, with fluctuating phosphorylation levels during the season. It was found that the phosphorylation rate of proteins decreased with the increasing time from the first sampling in the reproductive season. Additionally differential phosphorylation levels between stallion 2 and stallion 3 were observed for the 37 kDa phosphoprotein. Visualization of sialic acid binding in stallion sperm glycoproteins using biotinylated lectins WGA, MAL II and SNA revealed distinct glycosylation patterns. Subsequent statistical analyses of densitometric data emphasized significant differences in sialylation among the stallions. Furthermore an evaluation of total and progressive motility showed a significant difference in motility between stallion 1 and stallion 2. Due to the limited number of samples from stallion 1, it was not possible to evaluate the proteomic data. Nonetheless our results suggest that changes in the quantity and modifications of selected proteins could, to some extent, correlate with sperm motility and thus the fertilization capability of stallion sperm if more experimental data were obtained. However we were not able to collect stallion sperm during the reproductive season and precise data on stallion´s fertilization history were not provided to us.

Keywords

AKAP4, sialoproteiny, fosforylace, Western blot

Keywords

AKAP4, sialoproteins, phosphorylation, Western blotting

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 4. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 21. 5. 2024
• Supervisor: RNDr. Pavla Postlerová, Ph.D.
• Reader: Jana Antalíková, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / specializace:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology