Vývoj molekulárních markerů pro detekci kauzálních mutací genů zodpovědných za nestandardní strukturu a délku srsti u plemene československý vlčák

Bc. Barbora Karásková

Master's thesis

Development of molecular markers for the detection of causal gene mutations responsible for the non-standard structure and length of coat in the Czechoslovak wolfdog breed

Abstract:

V diplomové práci byla řešena kauzalita mutace genu KRT71, jejíž fenotypovým projevem je kadeřavá srst a kauzalita mutace genu FGF5 s fenotypovým projevem dlouhé srsti u plemene československý vlčák. Byl sledován výskyt mutací obou těchto genů a jejich případná kulumace v genotypu jedince. Jako kauzální mutace dlouhé srsti u plemene československý vlčák byla identifikována substituční mutace genu FGF5 c.284G>T. Doposud byly popsány u Canis lupus familiaris napříč plemeny dvě kauzální mutace genu KRT71 ve spojitosti s kadeřavou strukturou srsti. Mutace c.1266_1273delinsACA byla identifikována jako fixní pro plemeno curly coated retrívr. Substituční mutace c.451C>T byla pozorována u několika plemen s kadeřavou strukturou srsti. Kadeřavý fenotyp srsti je u československého vlčáka v jeho plemenném standardu definován jako vada vylučující jedince z chovu, frekvence tohoto fenotypu je proto nízká, nicméně mutovaná alela má své zastoupení v heterozygotní sestavě. Testovaná populace československých vlčáků byla záměrně sestavena tak, aby obsahovala jedince s nestandardní strukturou srsti. U všech jedinců byla provedena izolace genomické DNA získaná bukálím stěrem. Byly navrženy dvojice primerů pro obě mutace genu KRT71 a pro substituční mutaci genu FGF5. Amplikony byly separovány gelovou eletroforézou a následně sekvenovány. Sekvenace potvrdila kauzalitu mutace c.451C>T genu KRT71 u plemene československý vlčák. Neboť mutace c.451C>T způsobuje zánik restrikčního místa pro štěpení enzymem AciI, lze identifikovat genotyp jedinců metodou PCR-RFLP. Takto byly stanoveny genotypy a identifikováni jedinci nesoucí mutovanou alelu genu KRT71. I případě mutace c.284G>T genu FGF5, dochází ke ztrátě restrikčního místa, rozpoznávaného enzymem PstI a pro genotypizaci jedinců byla rovněž použita metoda PCR-RFLP. Vyhodnocením získaných molekulárních dat byly vypočteny četnosti a frekvence genotypů i alel obou genů. U obou genů byla statisticky analyzována heterozygotnost pozorovaná a heterozygotnost očekávaná ve vztahu k Hardy-Weinbergově rovnováze, přičemž signifikance rozdílu byla zjištěna pouze u genu KRT71. Možnou příčinou signifikantního rozdílu byl výběr jedinců do hodnocené populace s očekávaným výskytem mutované alely v homozygotní či v heterozygotní sestavě.

Abstract:

In the diploma thesis, the causality of the mutation of the KRT71 gene, whose phenotypic manifestation is curly fur, and the causality of the mutation of the FGF5 gene with the phenotypic manifestation of long fur in the Czechoslovak wolfdog breed were observed. The occurrence of mutations of both these genes and their possible cumulation in the individual's genotype was monitored. A substitution mutation of the FGF5 gene c.284G>T was identified as the causal mutation of the long coat in the Czechoslovak wolfdog. So far, two causal mutations of the KRT71 gene have been described in Canis lupus familiaris across breeds with the curly coat structure. The mutation c.1266_1273delinsACA was identified as fixed for the curly coated retriever. The substitution mutation c.451C>T has been observed in several breeds with a curly coat structure. The curly hair phenotype of the Czechoslovak wolfdog is defined in its breeding standard as a defect excluding individuals from breeding. The frequency of this phenotype is therefore low. However, the mutated allele is represented in the heterozygous set. The tested population of Czechoslovak wolfdogs was deliberately assembled in such a way as to contain individuals with a non-standard coat structure. Isolation of genomic DNA obtained by buccal swab was performed in all individuals. Primer pairs were designed for both mutations of the KRT71 gene and for the substitution mutation of the FGF5 gene. Amplicons were separated by gel electrophoresis and subsequently sequenced. Sequencing confirmed the causality of the c.451C>T mutation of the KRT71 gene in the Czechoslovak wolfdog. Because the c.451C>T mutation causes the disappearance of the restriction site for cleavage by the AciI enzyme, the genotype of individuals can be identified by the PCR-RFLP method. In this way, genotypes were determined and individuals carrying a mutated allele of the KRT71 gene were identified. Even in the case of the c.284G>T mutation of the FGF5 gene, the restriction site recognized by the PstI enzyme is lost, and the PCR-RFLP method was also used for the genotyping of individuals. By evaluating the obtained molecular data, frequencies and frequencies of genotypes and alleles of both genes were calculated. For both genes, the observed heterozygosity and the expected heterozygosity were statistically analyzed in relation to the Hardy-Weinberg equilibrium, while the significance of the difference was found only for the KRT71 gene. A possible cause of the significant difference was the selection of individuals in the evaluated population with the expected occurrence of the mutated allele in the homozygous or heterozygous set.

Keywords

československý vlčák, mutace, gen FGF5, gen KRT71, nestandardní struktura a délka srsti

Keywords

mutation, gen FGF5, gen KRT71, nonstandard structure and lenght of coat, Czechoslovakian wolfdog

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 4. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 16. 5. 2023
• Supervisor: doc. Dr. Ing. Pavel Vejl
• Reader: Kamila Nováková, Bc., externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / specializace:
Biotechnology / Biotechnology and Animal Breeding