Endogenně produkovaný sulfan v reprodukčním traktu samice ve vztahu k fertilizaci

Bc. Jiří BRICHCÍN

Master's thesis

Abstract:

Odhalení mechanismů zodpovědných za správný průběh oplození a časného embryonálního vývoje pomáhá v rozvoji asistované reprodukce člověka a technologií v chovech hospodářských zvířat. Jedním z regulačních mechanismů zapojených do reprodukce je gasotransmiter sulfan, jehož buněčná signalizace v pohlavních buňkách je dosud plně nepopsána. Dle stanovené hypotézy je sulfan uvolňován v samičím traktu, kde fyziologicky ovlivňuje spermie a je tak nezbytný pro oplození a vývoj prvojader. Cílem bylo ověřit expresi sulfan-uvolňujících enzymů a existenci časo-prostorového gradientu sulfanu v rámci estrálního cyklu myši (časová osa) a porovnání expresního profilu ampuly vejcovodu a uterotubálního spoje (prostorová osa). Experimenty probíhaly na modelu laboratorní myši (Mus musculus). Exprese sulfan-uvolňujících enzymů byla studována pomocí western blotu. Produkce sulfanu byla stanovena kolorimetrickou metodou. Úloha sulfanu v procesu oplození byla studována pomocí in vitro fertilizace spermiemi ošetřenými donorem sulfanu a imunocytochemického barvení takto vzniklých zygot. V rámci vaječníku a vejcovodu byla zjištěna exprese všech známých sulfan-uvolňujících enzymů, tj. cystationin--lyázy (CTH), cystationin-ß-syntázy (CBS) a 3-merkaptopyruvát sulfurtransferázy (3-MPST). Ani jeden z enzymů nevykazoval statisticky významné odlišnosti v expresi ve fázi estru a diestru. Analogické výsledky byly zjištěny i v rámci prostorové osy; ampula vejcovodu i uterotubální spoj exprimovaly enzymy CTH, CBS i 3-MPST, statistické odlišnosti však zaznamenány nebyly. To platí i v případě produkce sulfanu těmito tkáněmi. Vliv sulfanu na proces oplození byl analyzován podle laminu B1, markeru vývoje paternálního prvojádra. Provedená analýza nepotvrdila vliv donoru sulfanu na vývoj prvojader zygot. Práce prokázala, že sulfan je enzymaticky uvolňován tkáněmi reprodukčního traktu samice, bez ohledu na fázi estrálního cyklu či lokalizaci ve vejcovodu. Sulfan, který pochází z reprodukčního traktu samice, zde patrně fyziologicky ovlivňuje spermie, které jsou oplození schopné a vedou k vývoji prvojader.

Abstract:

The discovery of the mechanisms responsible for the proper process of fertilization and early embryonic development helps in the development of assisted human reproduction and technologies in livestock breeding. One of the regulatory mechanisms involved in reproduction is the gasotransmitter hydrogen sulfide, whose cellular signaling in germ cells is not fully described yet. According to the hypothesis, hydrogen sulfide is released in the female reproductive tract, where it physiologically affects sperm and is necessary for fertilization and the development of pronuclei. The aim was to verify the expression of hydrogen sulfide-releasing enzymes and the existence of a time-space gradient of hydrogen sulfide within the estrous cycle of the mouse (time axis) and to compare the expression profile of the fallopian tube ampulla and uterotubal junction (space axis). The experiments were performed on a laboratory mouse model (Mus musculus). The expression of hydrogen sulfide-releasing enzymes was studied by western blot. Hydrogen sulfide production was determined by colorimetry. The role of hydrogen sulfide in the fertilization process was studied by in vitro fertilization with hydrogen sulfide donor-treated sperm and by immunocytochemical staining of the zygotes. The expression of the known hydrogen sulfide-releasing enzymes, i.e. cystathionine--lyase (CTH), cystathionine-ß-synthase (CBS), and 3-mercaptopyruvate sulfurtransferase (3-MPST), was detected within the ovary and fallopian tube. Any enzymes did not show statistically significant differences in estrus and diestrus expression. Moreover, analogous results were found in the spatial axis; both the fallopian tube and the uterotubal junction expressed CTH, CBS, and 3-MPST enzymes, but no statistical differences were noted. Also, this applies to the production of hydrogen sulfide by these tissues. The effect of hydrogen sulfide on the fertilization process was analyzed according to lamin B1, a paternal pronucleus development marker. The performed analysis did not confirm the influence of the hydrogen sulfide donor on the development of the zygote pronuclei. The work showed that hydrogen sulfide is enzymatically released by the tissues of the female reproductive tract, regardless of the phase of the estrous cycle or the location in the fallopian tube. There is assumed a physiological influence of maternal-born hydrogen sulfide to sperm, which is capable of fertilization and leads to pronuclei development.

Keywords

sulfan, sulfan-uvolňující enzymy, CTH, CBS, 3-MPST, vaječník, vejcovod, zygota, IVF

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 4. 2022

Thesis defence

• Supervisor: doc. Ing. Roman Konečný, Ph.D.

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Agriculture and Technology

Master programme / field:
Animal husbandry / Animal husbandry