Apoptické změny v kryokonzerovaném ejakulátu hřebců

Filipa Bubeníčková

Master's thesis

Apoptotic changes in frozen-thawed ejaculate in stallions.

Abstract:

Cílem práce bylo zhodnotit vliv času inkubace, použitých obalů, ředidel a individuality hřebců na výskyt apoptotických spermií v rozmražených inseminačních dávkách (ID). Ejakulát byl odebrán od 6 starokladrubských hřebců standardním způsobem odběru. Odebrané ejakuláty byly ředěny dvěma typy žloutkocitrátových ředidel (GENT a LAKT) a plněny do 0,5 ml pejet a 5 ml hliníkových tub, ve kterých byly zmraženy a uchovávány v tekutém dusíku. Po rozmražení (37°C, 30-60 s.) byly ID hodnoceny na přítomnost apoptotických spermií ihned po rozmražení a v časech inkubace 15, 30, 45 a 60 minut po rozmražení s využitím fluorochromů Yo-Pro 1 a propidium jodidu a fluorescenčního mikroskopu. Byl zjištěn statisticky významný rozdíl v zastoupení apoptotických spermií po rozmražení mezi ID ředěnými různým typem ředidla. V ID mražených v ředidle Gent bylo vyšší množství apoptotických i apoptotických spermií z celkového počtu živých, což naznačuje lepší přežívání spermií v tomto ředidle oproti laktózovému ředidlu. Byl prokázán vliv použitého obalu na přítomnost apoptotických spermií v ID po rozmražení. V 5 ml tubách bylo ihned po rozmražení statisticky významně vyšší průměrné zastoupení apoptotických spermií než v 0,5 ml pejetách. S postupujícím časem inkubace nebyly už rozdíly významné. Naopak procentuální zastoupení apoptotických spermií z celkového počtu živých bylo vyšší v 0,5 ml pejetách. Statisticky významný byl však tento rozdíl s 5 ml tubami zaznamenán až po hodinové inkubaci. Zásadní rozdíly byly patrné až při porovnání kombinací použitých ředidel a obalů. Jako nejlepší, s přihlédnutím hlavně k údaji procentuálního zastoupení apoptotických spermií z celkového množství živých, se zdá být použití ředidla Gent a 5 ml tub. Významný vliv na zastoupení apoptotických spermií v kryokonzervovaných ID měla individualita hřebce. Pro zvýšení kvality produkovaných ID je třeba přistupovat ke každému hřebci individuálně, zvláště u plemen jako je starokladrubský kůň, u kterého vysoký stupeň inbreedingu může významně ovlivnit kvalitu ejakulátu a výslednou úspěšnost reprodukce.

Abstract:

The aim of the study was to evaluate the effect of incubation time, types of packaging , extenders and stallion´s individuality for the presence of apoptotic sperms after thawing insemination doses (ID). The semen was collected from six Old Kladrubian stallions by standard collection method. Collected ejaculates were diluted with two extender types (GENT and LAKT) and filled into 0.5 ml straws and 5 ml aluminum tubes in which were frozen and stored in liquid nitrogen. The ID were evaluated for the presence of apoptotic sperm immediately after thawing (37 °C, 30 - 60 sec.) and after incubation 15, 30, 45 and 60 minutes after thawing using fluorochromes Yo-Pro 1, propidium iodide and fluorescence microscopy. There was a statistically significant difference in the presence of apoptotic sperms in the ID diluted with different types of extender. In the ID frozen in Gent was higher number of apoptotic and apoptotic sperms from the total number of live cells. This results suggest a better survival rate of sperm in the extender Gent compared with lactate extender. It was shown the effect of packaging types for the presence of apoptotic sperms in the ID after thawing. Immediately after thawing there was statistically significantly higher average proportion of apoptotic spermatozoa in 5 ml tubes than in 0.5 ml straws. With incubation time the tests did not demonstrate any significant differences between different types of packaging. However, the percentage of apoptotic sperm cells from the total number of viable cells was higher in 0.5 ml straws. Nevertheless this difference was observed as statistically significant only after 1 hour incubation. When we compared the combination of the extender and the packaging type there were evident relevant differences. The common use of Gent and 5 ml tubes seems to give the best outcome. The stallion´s individuality had significant effect on the presence of apoptotic sperms in cryopreserved ID. To increase the quality of produced ID it must be treated individually to each stallion, especially in case of the Old Kladrubian horse breed. High level of inbreeding can significantly affect semen quality and the success of reproduction.

Keywords

hřebec, kryokonzervace, inseminační dávka, apoptóza

Keywords

cryopreservation, insemination dose, apoptosis, stallion

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 4. 2016

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Jiří Šichtař, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Genetic Technologies and Breeding / Biotechnology of Reproduction