Štúdium vplyvu šafranu siateho (Crocus sativus L.) na životaschopnosť nádorových buniek a ich schopnosť odpovedi na poškodenie DNA

Samuel ŠKOLUDA

Bachelor's thesis

Study of saffron (Crocus Sativus L.) influence on viability of tumor cell lines and its ability to repair DNA damage

Abstract:

Nádorové ochorenia sú pretrvávajúcim celosvetovým problémom s vysokou úmrtnosťou a nedostačujúcou liečbou. Okrem klasických, stále nezastupiteľných konvenčných metód liečby (chemoterapia, ožarovanie) sa výskum zaujíma aj o prírodné látky, ktoré môžu pôsobiť prevenčne voči nádorovým ochoreniam. Zaujímavé je tiež štúdium účinku prírodných látok v kombinácií s konvenčnými metódami. Príkladom práve takýchto látok sú koreniny, pod ktoré spadá aj šafran siaty (Crocus sativus L.). Témou bakalárskej práce je štúdium vplyvu celkového extraktu šafranu na životaschopnosť nádorovej línie HCT116 WT a overenie, či môže šafran zvýšiť citlivosť tejto línie k ionizujúcemu žiareniu alebo práve naopak, vykazovať ochranné účinky. Teoretická časť obsahuje zhrnutie všeobecných poznatkov o šafrane a mechanizmoch pôsobenia extraktu šafranu a jeho zložiek na životaschopnosť rôznych nádorových línií. Zahrnutá je taktiež problematika poškodenia DNA ionizujúcim žiarením (IR), mechanizmy opravy dvojvláknových zlomov DNA, regulácia kontrolných bodov bunkového cyklu a signálnych dráh vedúcich k oprave poškodenej DNA alebo bunkovej smrti. Experimentálna časť práce je zameraná na štúdium vplyvu celkového extraktu šafranu na životaschopnosť nádorovej línie HCT116 WT bez, a spolu s pôsobením IR. Po ošetrení buniek extraktom šafranu a následnom vystavení IR bola pomocou prietokovej cytometrie sledovaná distribúcia buniek v bunkovom cykle, hlavne prítomnosť sub-G1 populácie. Pomocou Western blotu v kombinácií s imunologickou detekciou bolo sledované, či ošetrenie šafranom vyvoláva aktiváciu proteínov regulujúcich odpoveď bunky na poškodenie DNA a taktiež aktiváciu kontrolných bodov bunkového cyklu. Imunofluorescenčné farbenie ukazovateľov poškodenia DNA ako je yH2AX, 53BP1 a BRCA1 v spojení s priamou mikroskopiou umožnilo overiť aktiváciu proteínov bunkovej odpovedi na poškodenie DNA vyvolanej pomocou IR. Výsledky tejto práce naznačujú, že ošetrenie buniek celkovým extraktom šafranu znižuje proliferáciu nádorovej línie HCT116 WT, predlžuje S fázu a mierne zvyšuje G2 fázu bunkového cyklu. Imunodetekciou pro-apoptických proteínov a proteínov odpovedajúcich na poškodenie DNA bol dokázaný vplyv šafranu na životaschopnosť bunkovej línie HCT116 WT a pokles schopnosti aktivácie proteínov podieľajúcich sa na regulácií schopnosti bunkovej odpovedi na DNA poškodenie po vystavení IR. Zároveň bol v kombinácií s IR pozorovaný senzitivizujúci vplyv extraktu šafranu na nádorovú líniu HCT116 WT. Na základe získaných dát sa môžeme domnievať, že celkový extrakt šafranu má mierny cytotoxický a senzitivizujúci vplyv na nádorovú líniu HCT116 WT, ktorý by mohol byť zosilnený spolu s použitím IR, čo bude predmetom ďalšieho štúdia.

Abstract:

Tumor diseases are a global persistent problem with high mortality and insufficient treatment. Aside from classical, still not replaceable conventional methods of treatment (chemotherapy, irradiation), research has begun to look for alternatives such as natural substances, that can act as preventive agents against cancer. Interesting is also the study of effect of natural substances in combination with conventional methods of treatment. An example of such substances are spices, which also include saffron (Crocus sativus, L.) The aim of this bachelor thesis is to study the effect of the total extract of saffron on the viability of HCT116 WT tumor cell line and to verify that saffron can increase the sensitivity of this line to ionizing radiation or, on the contrary, prove the protective attributes of saffron. The theoretical part summarizes the general knowledge of saffron and the mechanisms of action of saffron extract and its components, on the viability of various tumor cell lines. Covered are also DNA damage by ionizing radiation (IR) repair mechanisms for double-stranded DNA breaks, regulation of cell cycle checkpoints and signaling pathways leading to repair of damaged DNA or cell death. The experimental part is a study of the effect of the total extract of saffron on the viability of HCT116 WT tumor cell line without, and with IR. After treatment of the cells with saffron extract and subsequent IR exposure, cell distribution was monitored by flow cytometry with emphasis on presence of sub-G1 population. Using Western blot in combination with immunological detection proved to be a valuable tool in examining whether saffron treatment induced activation of the cell-responsive proteins to DNA damage and activation of cell cycle checkpoints. Immunofluorescence staining of DNA damage markers such as yH2AX, 53BP1 and BRCA1 followed by direct microscopy allowed verification of activation of cellular response proteins to IR-induced DNA damage. The results of this work demonstrate that treatment of cells with complete extract of saffron decreases proliferation of tumor cell line HCT116 WT, prolongs S phase and slightly increases G2 phase of cell cycle. With help of immunodetection of pro-apoptotic proteins and DNA damage response proteins an effect of saffron was proved on cell viability HCT116 WT tumor cell line and decrease of ability to activate proteins regulating cell response to DNA damage after exposure to IR. Furthermore, we have observed that saffron extract has sensitizing effect on HCT116 WT tumor cell line to IR. On the basis of acquired data we are suggesting that complete extract of saffron has mild cytotoxic and sensitizing effect on tumor cell line HCT116 WT and could be increased in combination with IR, which is a subject of further studies.

Keywords

šafran, nádorová línia HCT116 WT, krocín, Western blot, ionizujúce žiarenie, oprava DNA

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 6. 5. 2019

Thesis defence

• Supervisor: Mgr. Lucie Béresová, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biotechnology and Gene Engineering