Extracelulárně sekretované proteiny a peptidy bakterie Paenibacillus larvae

Mgr. Aleš KVASNIČKA

Bakalářská práce

Extracellularly secreted proteins and peptides by the bacterium Paenibacillus larvae

Anotace:

Včela medonosná (Apis mellifera) se řadí mezi nedůležitější opylovatele, na kterých závisí celosvětové výnosy zemědělsky a ekonomicky důležitých plodin. Ačkoliv se problému včelí imunity a celosvětového trendu snižování počtů opylovatelů nevěnuje dostatečná mediální pozornost, vědecký zájem o tuto problematiku stále roste. Mimo studium samotné včelí imunity se lze také zaměřit přímo na studium patogenů a parazitů včel. Tato práce je zaměřena na bakteriálních onemocnění mor včelího plodu, jehož přímým původcem je bakterie Paenibacillus larvae. V teoretické části práce byly specifikovány jednotlivé skupiny proteinů a peptidů s antimikrobiálními a toxickými vlastnostmi a dále byly také rozebrány mechanismy, jimiž tyto proteiny a peptidy narušují integritu fyzické obrany a imunity napadených organismů s konkrétním zaměřením na včelu medonosnou. V rámci současného stavu řešené problematiky byly popsány konkrétní doposud identifikované proteiny a peptidy, které bakterie P. larvae sekretuje do prostředí lumen střeva včelí larvy, případně do růstového média, s ohledem na dva nejrozšířenější genotypy této bakterie. V praktické části byly optimalizovány parametry kultivace obou zkoumaných genotypů bakterie P. larvae s ohledem na sekreci proteinů a peptidů do růstových médií. Bylo zjištěno, že pro optimální růst obou genotypů P. larvae je nezbytné před kultivací upravit pH MYPGP média pomocí KOH na hodnotu 7,3. Dále byla pro srážení proteinů z růstového média ověřena a vybrána technika srážení čistým vymraženým methanolem. Proteiny izolované z růstových médií byly elektroforeticky separovány, přičemž byla stanovena jejich přibližná molekulová hmotnost a jako nejlepší technikou barvení bylo na 12% polyakrylamidovém vybráno barvení koloidním CBB G-250. Porovnáním relativní mobility standardů a vzorků na gelech byly u obou genotypů bakterie P. larvae ERIC I a ERIC II identifikovány proteinové pásy o molekulových hmotnostech 74, 56 a 42 kDa jejichž intenzita se v průběhu kultivace zvyšovala. Dále byl pozorován společný proteinový pás pro oba genotypy v oblasti 49 kDa. U genotypu ERIC I byl detekován proteinový pás s přibližnou molekulovou hmotností 110 kDa.

Abstract:

The Honeybee (Apis mellifera) is one of the most important pollinators, on which depends the production of agriculturally and economically important crops worldwide. Even though the problems of bee immunity and the trend of declining number of bees are not stressed enough in the media, the scientific interest in this topic is steadily growing. The focus is not only aimed on the bee immunity, it can also be directed on the parasitic organisms e.g. viruses and bacteria. This thesis is primarily focused on the American foulbrood and its causative agent Paenibacillus larvae. Individual groups of proteins and peptides with antimicrobial and toxic properties were specified in the theoretical part of this thesis and furthermore the mechanisms, that disrupt the integrity of the physical defence and immunity were researched. This thesis focused on specific proteins and peptides, which are secreted by the bacterium P. larvae into the environment of the lumen of a honeybee larvae or into the growth metium were described. Parameters of cultivation were optimized for both genotypes of P. larvae (ERIC I and ERIC II) in the practical part of this thesis. It was discovered that the optimal growth of both studied genotypes of P. larvae is secured in the MYPGP medium with pH 7,3 adjusted by KOH. The optimal technique for protein precipitation form growth media was specified as the one using cold methanol. The isolated proteins were eletrophoreticaly separated. As the visualisation technique of protein bands on 12% polyacrylamide gel was selected the colloid CBB G-250. The approximate molecular weights of protein bands were determined by the comparison of relative mobility of strandards and the studied proteins on gels. Proteins with molecular mass 74, 56, 49 and 42 kDa were detected in the secretion samples of both genotypes ERIC I and ERIC II. Protein band coresponding to 110 kDa was found only in samples of genotype ERIC I.

Klíčová slova

Extracelulárně sekretované proteiny, mor včelího plodu, Paenibacillus larvae

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 14. 5. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 12. 6. 2018
• Vedoucí: Mgr. Jiří Danihlík, Ph.D.

UNIVERZITA PALACKÉHO V OLOMOUCI

Přírodovědecká fakulta

Bakalářský studijní program / obor:
Biochemie / Biochemie