Vliv butyrátu na vývoj střevního zánětu v experimentálním myším modelu

Bc. Barbora Draboňová

Master's thesis

Effect of butyrate on the development of intestinal inflammation in experimental mouse model

Abstract:

Ulcerózní kolitida (UC) je chronické, recidivující, zánětlivé onemocnění střeva. Etiologie onemocnění zahrnuje kombinaci genetické predispozice a faktorů prostředí, jako je nevhodná výživa, nadužívání antibiotik, stres a porucha rovnováhy střevní mikrobioty (tzv. dysbióza). Současné teorie patogeneze UC předpokládají, že právě patologické změny ve střevním mikrobiálním složení vyvolávají u geneticky predisponovaných jedinců abnormální slizniční imunitní odpověď, která vede k rozvoji střevního zánětu. U pacientů s UC bývá snížen počet bakterií produkujících mastné kyseliny s krátkým řetězcem (butyrát, propionát, acetát), které jsou, ve spojení střevní mikrobiotou, významnými modulátory imunitních funkcí. Cílem diplomové práce bylo studium vlivu butyrátu na rozvoj zánětlivé imunitní reakce v gnotobiotickém myším modelu UC. Byl sledován profylaktický účinek butyrátu na rozvoj střevního zánětu u konvenčních (CV) a bezmikrobních myší (GF) kmene BALB/c, kterým byl butyrát podáván do pití po dobu 1 nebo 2 týdnů před vyvoláním zánětlivého onemocnění. Poté byla akutní UC vyvolána podáváním 2,5% dextransulfátu sodného (DSS) v pitné vodě po dobu 7 dnů. Kontrolní skupině myší s rozvinutým zánětem střeva byl podáván pouze roztok 2,5% DSS v pitné vodě po dobu 7 dnů. Jako zdravé kontroly byly použity neléčené myši a myši, kterým byl podáván pouze roztok butyrátu v pití po dobu 2 týdnů. Makroskopické znaky zánětu střeva byly charakterizovány výskytem krvácení z rekta (okultní krvácení), průjmem, poklesem váhy myší a zkrácením délky tlustého střeva. Ochranný efekt butyrátu byl zaznamenán především u skupiny konvenčních myší, kterým byl butyrát podáván po dobu 2 týdnů před indukcí akutní UC, a které vykazovaly jen mírné zkrácení délky tlustého střeva a nepatrný výskyt okultního krvácení v porovnání s DSS skupinou myší s akutním střevním zánětem. U bezmikrobních myší nebyl patrný vliv podávání butyrátu na délku tlustého střeva ani na výskyt krvácení po podání DSS. Histologickou analýzou byly zaznamenány mikroskopické změny ve struktuře střevní sliznice. Kontrolní skupina konvenčních myší po sedmidenním podávání DSS vykazovala příznaky těžkého zánětu s velkou infiltrací prozánětlivých buněk, změnou v morfologii střevních krypt, ztrátou vrstvy epiteliálních buněk a sníženým výskytem mucus-produkujících buněk. Obě skupiny myší, kterým byl podáván butyrát (1 týden nebo 2 týdny) před vyvoláním akutní UC, vykazovaly jen mírné až střední morfologické změny ve střevní sliznici se zachovalou četností mucus-produkujících buněk. U bezmikrobních myší nebyl detekován rozdíl v histologickém hodnocení zánětlivých změn střevní sliznice mezi skupinou kontrolních myší s indukovaným střevním zánětem a myšmi, kterým byl podáván butyrát po dobu 1 nebo 2 týdnů před indukcí UC pomocí DSS. Všechny tyto skupiny vykazovaly jen mírnější mikroskopické známky zánětu, charakterizované jen mírnou infiltrací zánětlivých buněk. Produkce cytokinů byla dále sledována v supernatantech kultivovaných buněk mezenteriálních lymfatických uzlin a byla stanovena pomocí metody ELISA. U konvenčních i bezmikrobních skupin myší byla stanovena hladina prozánětlivého cytokinu TNF- α a protizánětlivého cytokinu IL-10. U konvenčních myší pouze skupina, která dostávala butyrát dva týdny před DSS, vykázala zvýšenou produkci cytokinu IL-10. V supernatantech všech skupin bezmikrobních myší poměr těchto dvou cytokinů nevykázal rozdíly mezi experimentálními skupinami. Efekt preventivního podávání butyrátu na funkci střevní bariéry byl stanoven imunohistochemic

Abstract:

kou analýzou proteinů těsných spojů, konkrétně zonula occludens (ZO ‒ 1). U konvenčních i bezmikrobních myší u kontrolní skupiny s indukovaným zánětem střeva byla produkce ZO ‒ 1 výrazně snížena. U ostatních experimentálních skupin byla detekována zachovaná struktura tohoto proteinu. Výsledky diplomové práce prokázaly ochranný efekt butyrátu na vznik střevního zánětu v experimentálním myším modelu akutní kolitidy. Experimenty s bezmikrobními myšmi, u kterých byl zaznamenán méně výrazný efekt butyrátu, potvrdily, že jeho pozitivní působení je vázáno na výskyt střevní mikrobioty.

Abstract:

Ulcerative colitis (UC) is a chronic recurrent inflammatory disease of the large intestine. The disease aetiology comprises a combination of genetic predisposition and environmental factors such as inappropriate nutrition, antibiotic misuse, stress and gastrointestinal disturbance (dysbiosis). Current theories on the pathogenesis of UC envisage that pathological changes in the intestinal microbial composition cause abnormal mucosal immune responses and in genetically predisposed people result in development of intestinal inflammation. The patients with UC have a reduced number of bacteria that produce short-chained fatty acids (butyrate, propionate, acetate), which are important bacterial modulators of immune functions in the intestine. The aim of my diploma thesis was to research the effects of butyrate on development of inflammatory immune responses, using a gnotobiotic mouse model of UC. A prophylactic action of butyrate on the development of intestinal inflammation was monitored in conventional mice (CV) and in germ-free (GF) mice of the BALB/c strain. Butyrate was administered in drinking water for 1 or 2 weeks prior acute UC induction by administration of 2,5% dextran sulphate sodium (DSS) in drinking water for 7 days. The control group with a developed intestinal infalmmation was given 2,5% DSS in drinking water only. Untreated mice and a group receiving butyrate for 2 weeks only were used as healthy controls. The macroscopic signs of an inflammatory disease of the large intestine were characterized by occurrence of rectal bleeding (occult blood), diarrhoea, body weight decrease, and a reduction of colon length. The protection effect of butyrate was observed particularly in the group of conventional mice that were given butyrate for 2 weeks before the induction of acute UC. This group displayed only a mild shortening of the lengths of the intestin and a slight occurrence of rectal bleeding in comparison to the DSS-treated group with an acute intestinal inflammation. On the other hand, no effect of administered butyrate on intestine length or on occurrence of bleeding was apparent in germ-free mice treated with DSS. Microscopic changes in the intestinal mucosa structure were assessed by histological evaluation. The control group of conventional mice that received DSS for 7 days showed symptoms of heavy inflammation with increased infiltration by pro-inflammatory cells, changes in morphology of intestinal crypts, a loss of epithelial cell layer and a reduced presence of mucus-producing cells. Both groups of butyrate-treated (for 1 week or 2 weeks) mice before induction of acute UC showed only mild or medium morphological changes in the intestinal mucosa with preserved number of mucus-producing cells. In germ-free mice, no signifikant difference in histological rating of inflammatory changes in intestinal mucosa was detected in the DSS-treated group with induced intestinal inflammation and both groups of mice that were treated with butyrate prior the induction of US by DSS. All these groups showed only mild microscopic signs of inflammation that was characterized by a moderate infiltration of inflammatory cells, only. Cytokine production was further monitored in supernatnts of cultured mesenteric lymph nodes by the ELISA method. The level a pro-inflammatory cytokines TNF-α and an anti-inflammatory cytokine IL-10 was determined in all groups of conventional and germ-free mice. In conventional mice, only the group treated with butyrate for 2 weeks prior DSS showed an increased production of the IL-10 cytokine. Among all groups of germ-free mice, there no differences in the TNF-α/IL-10 ratio. A prophylactic effect of the butyrate administration on intestinal barrier functions was determined by immunohistochemical analysis of tight junctions proteins, specifically, zonula occludens (ZO – 1). The production of ZO – 1 was markedly reduced in both conventional and germ-free mice treated with DSS only. On the contrary, pres

Abstract:

erved structure was detected in all other groups. Results of my diploma thesis document the protective effect of butyrate on a development of intestinal inflammation in the experimental mouse model of acute colitis. Moreover, the experiments in germ-free mice, in which a less pronounced effect of butyrate was observed, confirmed that its positive effect is linked to the presence of intestinal microbiota.

Keywords

ulcerózní kolitida, butyrát, myší model, dextran-sulfátový model kolitidy, dysbioza

Keywords

ulcerative colitis, butyrate, mouse model, dextran sulphate sodium model of colitis, dysbiosis

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 19. 4. 2021

Thesis defence

• Supervisor: prof. Ing. Eva Vlková, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme:
Companion Animal Management