Specifická úloha izoforem kinázy Akt v maligní transformaci

Bc. Tereza Souralová

Master's thesis

Specific roles of Akt kinase isoforms in malignant transformation

Abstract:

Serin-threonin kináza Akt, také nazývána proteinkináza B (PKB), má nezastupitelné místo v buněčné signalizaci a v mnoha buněčných procesech jako je proliferace, přežití, metabolismus glukózy, transkripce, neovaskularizace a syntéza proteinů. Tři izoformy kinázy Akt (Akt1, Akt2 a Akt3), produkty tří rozdílných genů, jsou i přes svou vysokou podobnost domén exprimovány v různých tkáních rozdílně a v posledních letech se ukazuje, že se liší i svou funkcí. Tato práce má za cíl objasnit úlohu izoforem kinázy Akt u buněčné linie neuroblastomu a popsat vliv inhibice či snížené exprese izoforem kinázy Akt na morfologii, proliferaci, buněčný cyklus, migraci a viabilitu spojenou s aplikací inhibitorů kinázy Akt. V této práci byly testovány ATP-kompetitivní inhibitory kinázy Akt, A-674563 a CCT128930, na linii neuroblastomu v různých prostředích, které se snaží přiblížit in vivo podmínkám panujícím v solidních nádorech. Bylo prokázáno, že acidóza snižuje cytotoxické účinky výše jmenovaných inhibitorů v normoxii i hypoxii. Při současném působení inhibitorů docházelo k aditivitě jejich cytotoxických účinků. Metodou CRISPR/Cas9 byly vytvořeny buňky neuroblastomu se sníženou expresí izoforem kinázy Akt (buňky Akt-) a také klony s geneticky deletovanými izoformami kinázy. Ukázalo se, že buňky Akt3- (se sníženou expresí izoformy Akt3) se nejenom liší svojí morfologií, ale i statisticky signifikantně více proliferují, a naopak méně migrují. U buněk Akt3- lze detekovat i sníženou hladinu exprese vimentinu, což by mohlo souviset s jejich odlišnou morfologií. Pro všechny buňky Akt- se statisticky signifikantně zvýšil procentuální podíl buněk ve fázích buněčného cyklu G2/M. Buňky Akt3- jeví i známky určité rezistence vůči inhibitoru CCT128930. Z těchto výsledků lze usuzovat, že izoformy kinázy Akt, především Akt3, u neuroblastomu zastávají odlišnou funkci a jejich cílená inhibice zprostředkovaná specifickými inhibitory by mohla být v budoucnu vhodnou léčbou.

Abstract:

The serin-threonin kinase Akt, also known as proteinkinase B (PKB) is irreplaceable in cell signaling and in many cellular processes such as proliferation, survival, glucose metabolism, transcription, neovascularization and protein synthesis. Three Akt isoforms (Akt1, Akt2 and Akt3), products of three different genes, are expressed differently in various tissues despite their high domain similarity. In recent years, it has been shown that they differ also in their functions. This thesis aims to clarify the role of Akt kinase isoforms in neuroblastoma cell line and to describe the effect of inhibition or reduced expression of Akt kinase isoforms on morphology, proliferation, cell cycle, migration and viability associated with the use of Akt kinase inhibitors. In this thesis, the ATP-competitive inhibitors of kinase Akt, A-674563 and CCT128930, were tested on the neuroblastoma line in various environments that attempt to approximate in vivo conditions present in solid tumors. Acidosis has been shown to reduce cytotoxic effects of the both mentioned inhibitors in normoxia and hypoxia. When placed together, inhibitors show additive effects regarding their cytotoxic abilities. Populations of neuroblastoma cells with reduced expression of Akt kinase isoforms (Akt- cells), as well as clones with knockout isoforms of Akt kinase were created by CRISPR/Cas9 technology. It has been shown that Akt3- cells not only differ in terms of their morphology but also statistically significantly more proliferate and migrate less. A decreased expression of vimentin can also be detected in Akt3- cells, which may be related to their different morphology. For all Akt- cells, the percentage of cells in the G2/M phases of cell cycle was statistically significantly increased. Akt3- cells also show signs of some resistance to inhibitor CCT128930. From these results can be concluded that Akt kinase isoforms, in particular Akt3, have a different function in neuroblastoma and their targeted inhibition mediated by specific inhibitors could be a suitable treatment in the future.

Keywords

kináza Akt, izoformy Akt, Akt1, Akt2, Akt3, rakovina, inhibitor Akt, neuroblastom, nádorové mikroprostředí, Akt kinase, Akt isoforms, cancer, Akt inhibitor, neuroblastoma, cancer microenvironment

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 7. 5. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 5. 6. 2018
• Supervisor: Mgr. Jarmila Navrátilová, Ph.D.
• Reader: RNDr. Petr Chlapek, DiS.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Molecular Biology and Genetics