Porovnání metod pro stanovení antioxidační aktivity

Petra Belfínová

Bachelor's thesis

Comparison of methods for determination of antioxidant activity

Abstract:

Antioxidanty chrání lidský organismus proti oxidačnímu stresu způsobenému působením volných radikálů, které při nadměrném množství poškozují buňky a tím se mohou podílet na vzniku chronických onemocnění. Antioxidanty lze rozdělit na endogenní, tedy přirozeně se vyskytující v těle, a exogenní, které mohou mít zásadní význam při prevenci onemocnění a je nutné je přijímat potravou. Jednotlivé druhy antioxidantů se liší v závislosti na jejich zdroji, množství a polaritě. Také jejich kombinace, působení světla a teplota může ovlivnit výslednou antioxidační aktivitu. Díky této rozmanitosti bylo vyvinuto velké množství různých metod pro stanovení antioxidační aktivity. Existují dvě základní skupiny metod, jednou z nich jsou metody založené na přenosu atomů vodíku a druhou, větší skupinu tvoří metody založené na přenosu elektronů, které mohou být založeny buď na odbarvování – snížení absorbance nebo naopak na zvýšení absorbance v přítomnosti antioxidantu. Další metody stanovují schopnost antioxidantů vychytávat reaktivní formy kyslíku, jako je peroxid vodíku (H2O2), peroxynitrit (ONOO•), hydroxylový radikál (HO•), superoxidový anion (O2•-) a singletový kyslík (1O2). Již méně používané jsou in vivo metody, kdy jsou testované vzorky obvykle podávány pokusným zvířatům. Ze všech metod je nejpoužívanější metoda DPPH. Výsledky různých metod se mohou výrazně lišit, proto se doporučuje použití více metod pro stanovení antioxidační aktivity. V praktické části této práce byl měřen celkový obsahu fenolů u vybraných vzorků (zelený čaj, pomerančový džus, kakao a rozmarýn) s použitím Folin-Ciocalteuova činidla v kyvetách a na mikrotitračních destičkách za účelem srovnání. Jako standard byla použita gallová kyselina a celkový obsah fenolů byl vyjádřen jako obsah ekvivalentu gallové kyseliny (GAE) na 100 ml nebo 100 g vzorku. Výsledné hodnoty naměřené na mikrotitračních destičkách byly přibližně dvakrát větší než hodnoty v kyvetách, ale podle výsledků statistické analýzy se tyto metody neliší (p > 0,05). Průměrná antioxidační aktivita vzorků klesala v pořadí fresh > džus > čaj 80 °C > čaj 100 °C (vyjádřeno na objem vzorku) a rozmarýn > kakao (vyjádřeno na hmotnost vzorku). Dle statistické analýzy není rozdíl mezi antioxidační aktivitou zelených čajů zalitých vodou o různé teplotě (p > 0,05), ani mezi kupovaným a čerstvě vymačkaným pomerančovým džusem (p > 0,05).

Abstract:

Antioxidants protect the human body against oxidative stress caused by free radicals, which can in excessive amount damage cells and participate in development of chronic diseases. Antioxidants can be divided into two groups: endogenous, which are naturally occurring in the body, and exogenous, which can be essential in the prevention of diseases and are ingested through food. Antioixdant aktivity of individual anioxidants differ depending on their source, amount and polarity. Combination of antioxidants, light exposure and temperature can also affect the resulting antioxidant activity. Due to this diversity, a large number of different methods have been developed to determine the antioxidant activity. There are two basic groups of methods, one of them are methods based on hydrogen atom transfer. The second, larger group are methods based on electron transfer, which can be either based on decolorisation – a decrease of absorbance or on an increase of absorbance in the presence of antioxidant. Other methods determine the ability of antioxidants to scavenge reactive oxygen species such as hydrogen peroxide (H2O2), peroxynitrite (ONOO•), hydroxyl radical (HO•), superoxide anion (O2•-) and singlet oxygen (1O2). In vivo methods, where the tested samples are usually administered to experimetal animals, are less used. Of all the methods, the most frequently used is DPPH method. The results of various methods can be significantly different, therefore the use of multiple methods to determine antioxidant activity is recommended. In the practical part of this work, comparison of using cuvettes and microtiter plates for determination of the content of total phenolic compounds of selected samples (green tea, orange juice, cocoa, and rosemary) was provided. Gallic acid was used as a standard for quantification by the calibration curve. The total phenolic content values were expressed as gallic acid equivalent (GAE) content per 100 ml or 100 g of sample. The results measured on microtiter plates were approximately twice as big as the values in the cuvettes, but according to the results of statistical analysis, these methods weren‘t significantly different (p > 0,05). The average antioxidant activity of the samples decreased as follows: fresh > juice > tea 80 °C > tea 100 °C (volume) and rosmery > cocoa (weight). According to statistical analysis, there was no difference between the antioxidant activity of green teas poured with water at different temperatures (p > 0,05), nor between purchased and freshly squeezed orange juice (p > 0,05).

Keywords

Folin-Ciocalteuovo činidlo, polyfenoly, volné radikály, zelený čaj, antioxidanty

Keywords

antioxidants, Folin-Ciocalteu’s reagent, polyphenols, free radicals, green tea

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 7. 2020

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Monika Sabolová, Ph.D.
• Reader: Zuzana Réblová, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Bachelor programme / field:
Agriculture, Horticulture and Rural Development / Nutrition and Foodstuffs