Optimalizace podmínek purifikace enzymů z biologického materiálu

Bc. Jan Dosedla

Diplomová práce

Optimization of procedure for enzyme purification from biological material

Anotace:

Glutathionreduktáza (GR) je enzym patřící do třídy oxidoreduktáz. Uplatnění nachází při přeměně oxidované formy glutathionu na redukovanou. Glutathion se v organizmu podílí na celé řadě fyziologických a metabolických funkcí. Glutathion především chrání organizmus před oxidačním stresem. Dále pak udržuje vitamíny v redukované formě, podílí se na detoxikaci xenobiotikých látek a transportu aminokyselin přes buněčnou membránu, a udržuje redukční prostředí v erytrocytech. Nejčastěji využívanými metodami při purifikaci glutathionreduktázy jsou v současnosti precipitace síranem amonným, dialýza a afinitní chromatografie. Cílem naší práce bylo optimalizovat jednotlivé kroky purifikace a jejich parametry, abychom zkrátili čas purifikace a zvýšili její účinnost. Testovali jsme optimální koncentraci síranu amonného při precipitaci standardu glutathionreduktázy a následně jsme tento pokus opakovali s lidskou krví. V případě precipitace standardu jsme určili jako optimální pro precipitaci glutathionreduktázy rozmezí saturace síranu amonného 50 % až 80 %. Poté jsme testovali optimální saturaci síranu amonného pro precipitaci GR na vzorku se složitější matricí (lyzovaných lidských erytrocytech). V tomto případě byla nalezená optimální saturace v rozmezí 4060 %. Při tomto pokusu bylo zjištěno, že při saturaci 50-60 % síranu amonného precipituje z roztoku lyzovaných erytrocytů většina proteinů. V dalším pokuse jsme navázali standard glutathionreduktázy na stacionární fázi afinitní chromatografie (2´,5´-ADP-agrarózu). Následně jsme provedli eluci GR, zachycení eluované mobilní fáze do mikrozkumavek a stanovení aktivity GR a koncentrace proteinů v eluovaném roztoku. V rámci další práce byla provedena kompletní purifikace glutathionreduktázy z odebraného vzorku krve. V tomto pokusu jsme získali glutathionreduktázu z lyzovaných lidských erytrocytů pomocí precipitace síranem amonným, dialýzy a afinitní chromatografie s výtěžkem 23 % a se stupněm očištění 4780.

Abstract:

Glutathione reductase (GR) is an enzyme belonging to the class of oxidoreductases. It is used in the conversion of oxidized glutathione to reduced form. Glutathione in the organism participates in a number of physiological and metabolic functions. Glutathione primarily protects the body against oxidative stress. Furthermore keeps vitamins in reduced form, is involved in the detoxification xenobiotic substances and amino acid transport across the cell membrane and maintains a reducing environment in erythrocytes. The most commonly used methods for purification of glutathione reductase are currently ammonium sulfate precipitation, dialysis, and affinity chromatography. The aim of our study was to optimize the individual purification steps and their parameters to shorten the time for purification and increase its effectiveness. We tested the optimal concentration of ammonium sulfate for precipitation at standard of glutathione reductase and consequently we repeated the experiment with human blood. In the case of standard precipitation we had identified as optimal for the precipitation of glutathione reudctase ranging saturation of ammonium sulfate of 50 % to 80 %. After that we tested the optimal saturation of ammonium sulfate for precipitation GR sample with complex matrices (lysed human erythrocytes). In this case, it was found optimal saturation of 40-60%. In this experiment it was found that most proteins are precipitated from the solution of lysed erythrocytes between 50 to 60% saturation of ammonium sulphate. In another experiment, we purified standard of glutathione reductase using 2', 5'-ADP-agrarose as the stationary phase for affinity chromatography. Subsequently, the elution was performed, the eluted mobile phase was captured into microtubes and glutathion reductase activity and concentration of proteins in the eluted solution was determined. In a further work was done complete purification of glutathione from the blood sample. In this experiment, we obtained glutathione reductase from lysed human erythrocytes using ammonium sulfate precipitation, dialysis, and affinity chromatography with a yield of 23% and purification fold 4780.

Klíčová slova

glutathion, glutathionreduktáza, purifikace, afinitní chromatografie

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 12. 5. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 8. 6. 2016
• Vedoucí: doc. RNDr. Tomáš Roušar, Ph.D.

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Magisterský studijní program / obor:
Speciální chemicko-biologické obory / Analýza biologických materiálů