Detekce faktorů virulence u bakterií skupiny Bacillus cereus

Bc. Michaela Šebestová

Master's thesis

Detection of Bacillus cereus group virulence factors

Abstract:

Bakterie skupiny B. cereus jsou široce rozšířeny v prostředí a významné jsou zejména v souvislosti s potravinami, jakožto etiologičtí činitelé alimentárních otrav. Zároveň se mohou podílet i na kažení potravin. Významnou roli v patogenezi otrav hrají extracelulární toxiny, které mohou produkovat. Cílem diplomové práce bylo stanovení toxigenního profilu 105 kmenů izolovaných z potravin, krmiv a životního prostředí a zhodnocení jejich potenciálního rizika pro lidské zdraví. Dále bylo posuzováno, zda se patogenní profil mezi kmeny liší v závislosti na jejich původu. Patogenní potenciál byl stanoven detekcí genů pro cereulid (ces), hemolyzin BL (hbl), nehemolytický enterotoxin (nhe), cytotoxin K (cytK), cereolyzin O (clo), hemolyzin II (hlyII), hemolyzin III (hlyIII), immune inhibitor A (inhA2), fosfatidylinositol-specifickou fosfolipázu C (phosC), fosfatidylcholin-preferující fosfolipázu C (cerA), a sfingomyelinázu (cerB) metodou PCR. Stanoven byl také potenciál pro quorum quenching detekcí genu pro AHL-laktonázu (aiiA). Převážná většina kmenů v této práci byla identifikována jako B. cereus sensu stricto, ostatní druhy byly zastoupeny pouze v malém počtu. U všech testovaných bakterií byly nalezeny nejméně 2 toxinové geny, u žádného se však nevyskytoval ces ani hbl. Nejvyšší prevalence byla pozorována u hlyIII (99 %), clo (96 %), cerA (94 %), nhe (91 %), piplc (90 %) a cerB (90 %). Poměrně častý byl také cytK (53 %). Málo byl naopak detekován hlyII (16 %) a inhA2 (3 %). Potenciál pro quorum quenching byl zjištěn u 68 % kmenů. V prevalenci 4 genů (aiiA, cytK, hlyII a piplc) byly prokázány statisticky významné rozdíly mezi kmeny různého původu. Nikdy se však vzájemně nelišily izoláty ze všech posuzovaných prostředí. Prevalence aiiA a cytK byla nejvyšší u kmenů z jedlého hmyzu (98 % a 100 %) a výrobků z hmyzu (91 % a 82 %), hlyII u izolátů z výrobků z hmyzu (45 %), ostatních potravin (40 %) a kategorie ostatní (40 %) a piplc dominoval u izolátů z krmiva pro psy (100 %), jedlého hmyzu (98 %), výrobků z hmyzu (100 %) a ostatních potravin (100 %). Na základě přítomnosti jednotlivých genů pro faktory virulence v genomu byly bakterie rozděleny do 19 patotypových skupin. Nejčastější byla skupina č. 6 (37 kmenů), která byla zastoupena zejména kmeny z jedlého hmyzu a nesla geny nhe, cytK, clo, hlyIII, piplc, cerA a cerB. Druhá nejpočetnější pak byla skupina č. 8 (35 kmenů), která se odlišovala absencí genu pro cytotoxin K a nejvíce se vyskytovala v krmivu pro psy. U těchto 2 patotypových skupin, byly prokázány statisticky významné rozdíly ve výskytu mezi sledovanými prostředími. Druh B. cereus sensu stricto a ostatní druhy se od sebe statisticky významně lišily pouze v prevalenci genů cytK a piplc, které byly častější u B. cereus s. s. Jiné rozdíly mezi nimi nalezeny nebyly. Jelikož naprostá většina kmenů měla ve své genetické výbavě předpoklady pro produkci alespoň jednoho enterotoxinu a k tomu i dalších faktorů virulence, potenciálně by u člověka mohla vyvolat průjmové onemocnění. Větší potenciál oproti ostatním kmenům byl pozorován u izolátů z jedlého hmyzu a výrobků z hmyzu, jelikož měly vyšší prevalenci enterotoxinového genu cytK. U žádného z kmenů nebyly detekovány geny pro cereulid, tudíž by neměly představovat riziko emetického syndromu.

Abstract:

Bacteria of B. cereus group are widely distributed in the environment and in connection with food they are known for their ability to cause foodborne diseases. They can be involved in food spoilage as well. The toxins they may produce play an important role in the pathogenesis of the disease. The aim of the diploma thesis was to determine the toxigenic profile of 105 strains isolated from food, feed and the environment and to evaluate the potential threat for human health they may pose. It was further assessed whether the pathogenic profile differed between strains of different origin. The pathogenic potential was assessed based on the detection of genes for cereulide (ces), hemolysin BL (hbl), non-hemolytic enterotoxin (nhe), cytotoxin K (cytK), cereolysin O (clo), hemolysin II (hlyII), hemolysin III (hlyIII), immune inhibitor A (inhA2), phosphatidylinositol-specific phospholipase C (piplc), phosphatidylcholine-preferring phospholipase C (cerA), sphingomyelinase (cerB) using the PCR method. Quorum quenching potential was evaluated by the detection of AHL-lactonase gene (aiiA) as well. Most of the strains in this thesis were identified as B. cereus sensu stricto, while other species were much less common. Each of the bacteria tested carried at least 2 toxin genes. However, none of them harboured ces or hbl. The highest prevalence was observed for hlyIII (99 %), clo (96 %), cerA (94 %), nhe (91 %), piplc (90 %) a cerB (90 %). The cytotoxin K gene was also detected in a number of strains (53 %). On the other hand, hlyII (16 %) and inhA2 (3 %) were not found to be frequent among the isolates. The potential for quorum quenching was confirmed for 68 % of the strains. The prevalence of 4 of the genes (aiiA, cytK, hlyII a piplc) differed statistically significantly between the isolates of distinct origin. Nevertheless, the difference was never found between the strains from all the assessed environments. The highest prevalence of aiiA and cytK was found among isolates from edible insects (98 % and 100 %) and edible insect products (91 % and 82 %). HlyII was most common in strains from edible insect products (45 %), other foodstuff (40 %) and other environments (40 %). Piplc prevailed in dog food (100 %), edible insects (98 %), edible insect products (100 %) and other foodstuff (100 %) isolates. The bacteria were divided into 19 pathotype groups based on the presence of virulence genes in their genome. Group no. 6 (37 strains), which consisted mostly of the edible insect isolates, was the most common. It harboured the following genes: nhe, cytK, clo, hlyIII, piplc, cerA a cerB.The second most common group (no. 8, 35 strains) differed from group no. 6 in the absence of cytK gene. This group was most prevalent in dog food. Statistically significant differences in incidence of these 2 pathotype groups were observed between the monitored environments. The B. cereus sensu stricto species differed statistically significantly from other species only in prevalence of cytK and piplc genes, which were more common among B. cereus s. s. strains. Other differences were not observed. As the vast majority of strains carried at least one enterotoxin gene along with other virulence genes, they might potentially cause diarrhoeal disease in humans. Greater potential to cause the disease was observed for edible insect and insect product isolates as they had a higher prevalence of the cytK enterotoxin gene. None of the isolates were tested positive for the cereulide genes, therefore they should not pose a risk of emetic syndrome.

Keywords

Bacillus cereus, emetický toxin, enterotoxiny, hemolyziny, alimentární onemocnění, PCR

Keywords

emetic toxin, enterotoxins, hemolysins, foodborne diseases, Bacillus cereus, PCR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 4. 2022

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Hana Šubrtová Salmonová, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme:
Food and Nutrition