Molekulárna analýza degradácie proteínov lokalizovaných v membráne endoplazmatického retikula

Bc. Nikola Perašínová

Master's thesis

Molekulární analýza degradace proteinů lokalizovaných v membráně endoplazmatického retikula

Anotácia:

Degradace nesprávně složených proteinů prostřednictvím dráhy zvané ERAD (z angl. endoplasmic reticulum-associated degradation) je proces zprostředkován pomocí proteinových komplexů v membráně endoplazmatického retikula. Součástí těchto komplexů jsou E3 ubikvitin ligázy, které ubikvitinujú substráty - nesložené proteiny určené k degradaci. Rodina RMA (z angl. RING membrane-anchor) E3 ubikvitin ligáz a jejich potenciální substráty jsou v rostlinách málo prozkoumanou oblastí, a proto bylo hlavním cílem této závěrečné práce využitím diferenciální centrifugace, metody western blot a následnou imunodetekcí analyzovat potenciální substráty v liniích rostlin Arabidopsis thaliana nesoucích mutace v rodině genů RMA E3 ubikvitin ligáz. Mezi geny RMA2 a RMA3 byla prokázána genová vazba, protože křížením mutantních linií nebylo možné získat dvojitého mutanta rma2,3 ani trojitého mutanta rma1,2,3. Využitím barvení proteinů v polyakrylamidovém gelu pomocí stříbra byl získán profil proteinů dvojitých mutantů rma1,2 i rma1,3 během stresu endoplazmatického retikula vyvolaného působením tunikamycinu. Proteomická analýza akumulovaných proteinů v získaných membránových frakcích mutantních linií by mohla v budoucnu objasnit nové potenciální substráty této rodiny E3 ubikvitin ligáz.

Abstract:

Degradation of misfolded proteins via the endoplasmic reticulum-associated degradation (ERAD) pathway is a process mediated by protein complexes in the endoplasmic reticulum membrane. E3 ubiquitin ligases which ubiquitinate substrates – unfolded proteins destined for degradation are an important part of these complexes. RING-membrane anchor (RMA) E3 ubiquitin ligase family and its potential substrates are not well-studied in plants, therefore the main goal of this master thesis was to analyze potential substrates in mutant Arabidopsis thaliana lines carrying mutations in the RMA E3 ubiquitin ligases genes using differential centrifugation, western blot method and subsequent immunodetection. Between the RMA2 and RMA3 genes is the genetic linkage which was proved by unsuccessful obtaining rma2,3 double mutant or the rma1,2,3 triple mutant by crossing the mutant lines. Using silver staining of proteins in a polyacrylamide gel, a protein profile of both rma1,2 and rma1,3 double mutants was obtained during tunicamycin induced endoplasmic reticulum stress. Proteomic analyses of accumulated proteins in the obtained membrane fractions of mutant lines could elucidate new potential substrates of this family of E3 ubiquitin ligases in the future.

Abstract:

Degradácia nesprávne zložených proteínov prostredníctvom dráhy nazývanej ERAD (z angl. endoplasmic reticulum-associated degradation) je proces sprostredkovaný pomocou proteínových komplexov v membráne endoplazmatického retikula. Súčasťou týchto komplexov sú E3 ubikvitín ligázy, ktoré ubikvitinujú substráty – nezložené proteíny určené k degradácii. Rodina RMA (z angl. RING membrane-anchor) E3 ubikvitín ligáz a ich potenciálne substráty sú v rastlinách málo preskúmanou oblasťou, a preto bolo hlavným cieľom tejto záverečnej práce využitím diferenciálnej centrifugácie, metódy western blot a následnou imunodetekciou analyzovať potenciálne substráty v líniách rastlín Arabidopsis thaliana nesúcich mutácie v rodine génov RMA E3 ubikvitín ligáz. Medzi génmi RMA2 a RMA3 bola dokázaná génová väzba, pretože krížením mutantných línií nebolo možné získať dvojitého mutanta rma2,3, či trojitého mutanta rma1,2,3. Využitím farbenia proteínov v polyakrylamidovom géli pomocou striebra bol získaný profil proteínov dvojitých mutantov rma1,2 aj rma1,3 počas stresu endoplazmatického retikula vyvolaného pôsobením tunikamycínu. Proteomická analýza akumulovaných proteínov v získaných membránových frakciách mutantných línií by mohla v budúcnosti objasniť nové potenciálne substráty tejto rodiny E3 ubikvitín ligáz.

Kľúčové slová

E3 ubikvitin ligázy, RMA geny, diferenciální centrifugace, ERAD

Keywords

E3 ubiquitin ligases, RMA genes, differential centrifugation, ERAD

Kľúčové slová

ERAD, diferenciálna centrifugácia, E3 ubikvitín ligázy, RMA gény

Jazyk práce: Slovak

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 5. 5. 2020

Obhajoba závěrečné práce

• Vedúci: Mgr. Jan Zouhar, Ph.D.
• Oponent: Markéta Šámalová, Ph.D.

Mendel University in Brno

Faculty of AgriSciences

Master programme / odbor:
Plant Production / Plant Biotechnology