Iniciace pohybu byčíku, signalizace a regulace motility spermatu ryb: fyzikální a biochemická kontrola

MSc. Galina PROKOPCHUK

Doctoral thesis

Flagellar movement initiation, signaling and regulation of fish spermatozoa: physical and biochemical control

Abstract:

Tato studie se pokouší vrhnout světlo na regulační procesy a uspořádání odezvy rybích spermií v průběhu zrání a iniciace motility. Prvním záměrem této studie bylo zlepšit porozumění mechanismům odpovědných za akvizici potenciálu pro motilitu spermatu u jeseterů. Fyziologické procesy, kterým podléhá dozrávání spermatu, nebyly dosud vůbec u tohoto druhu popsány. Naše výsledky ukazují, že dozrávání spermatu u jesetera nastává mimo testes kvůli zředění spermatu močí a zahrnuje účast sloučenin s vysokou molekulární hmotností stejně jako přítomnost iontů vápníku v seminální tekutině a/nebo moči. Druhým cílem této práce studium vyrovnávacího mechanismu u rybího spermatu s osmotickým a iontovým modem aktivace, stejně jako u spermatu euryhalinních druhů ryb, při různých podmínkách prostředí. Ukázali jsme, že změna osmolality prostředí může ovlivnit rybí sperma různými způsoby, což závisí na druhu ryby a módu aktivace motility spermatu - buď osmotickém či iontovém. V odpovědi na osmotický stres způsobený hypotonicitou, sperma kapra reguluje tok vody napříč buněčnou membránou a zvyšuje svůj cytoplasmatický objem během své krátké periody motility. V kontrastu, nebyla pozorována žádná indikace změn v objemu ani u jesetera malého ani u sivena amerického, oba mající iontový mód aktivace motility. V této studii jsme se zabývali mechanismem, kterým lze přizpůsobit spuštění motility spermatu euryhalinních ryb v odlišném rozsahu salinity prostředí. Naše výsledky ukazují, že sperma euryhalinní tilápie (Sarotherodon melanotheron heudelotii) odchované v sladké, slané i hypersalinní vodě může být aktivováno v hypotonickém, isotonickém i hypertonickém prostředí za předpokladu, že ionty Ca2+ jsou přítomny na různých úrovních. Bylo zjištěno, že čím vyšší salinita při odchovu ryb nebo čím hypertoničtější okolní medium při aktivaci spermatu, tím vyšší extracelulární koncentrace iontů Ca2+ je vyžadována. Zjistili jsme také, že bez ohledu na salinitu při odchovu ryb, mechanismus aktivace spermatu u této euryhalinní tilápie zůstává stejný. Výsledky získané v této studii umožňují domněnku, že osmolalita není hlavní faktor inhibující motilitu uvnitř testes u S. melanotheron heudelotii. Třetím cílem této studie bylo zjištění iniciačního procesu regulace motility a popis iniciace pohybu bičíku u spermatu chrupavčitých ryb. U lososovitých a jeseterů, regulace aktivace motility spermatu je zejména přičítána snížení extracelulární koncentrace K+ při přechodu spermatu ze seminální tekutiny do sladké vody, kde osmolalita stejně jako koncentrace K+ je mnohem nižší. Zjistili jsme, že u spermatu jesetera inhibice K+ může být překlenuta díky pre-expozici buněk spermatu vyššímu osmotickému šoku před jeho přechodem do K+ bohatého prostředí plavacího media. Navíc, po tomto ošetření, motilita spermatu jesetera se stává necitlivá k vysoké koncentraci extracelulárního K+. Proto se domníváme, že sperma jesetera může být aktivováno užitím neočekáváné signální dráhy, nezávisle na pravidelné stimulaci iontů. Postupné aktivační kroky u spermatu jesetera byly zaznamenávány vysokorychlostní kamerou s užitím specifické experimentální situace, kdy iniciace motility spermatu byla zpožděna v čase až o několik sekund. Při iniciaci motility, prvních pár vlnění vznikajících v bazálním regionu se začíná šířit i směrem ke špičce bičíku, ale postupně slábne směrem ke středu bičíku. Toto chování se několikrát opakuje až do stavu, kde amplitudy vlnění postupně dosáhnou podobných hodnot, což eventuálně vede k progresivnímu posunu spermie. Celkový čas potřebný pro přechod bičíku z imobilního stavu s rigidním tvarem do plné aktivity

Abstract:

s pravidelně šířeným vlněním se pohybuje v rozmezí 0.4 až 1.2 sek. Závěrem, výsledky této studie přinášejí cenné kousky informací do obecného porozumění procesu dozrávání rybího spermatu, jeho schopnosti přizpůsobit se rozdílným fyzikálním a biochemickým okolnostem, extra i intra celulární signalizaci stejně jako regulačním mechanismům aktivace motility rybího spermatu

Abstract:

The current study attempted to shed light on the regulatory processes and response arrangements of fish spermatozoa during the course of maturation and motility initiation. The first intent of this study was to improve the understanding of the mechanism underlying the acquisition of potential for sperm motility in sturgeon. Up to present work, the physiological process underlying sperm maturation in this species has not been described at all. Our results showed that sperm maturation in sturgeon occurs outside the testes because of dilution of sperm by urine and involves the participation of high molecular weight substances as well as calcium ions present in seminal fluid and/or urine. The second aim of the present study was to investigate the coping mechanisms in fish spermatozoa with osmotic and ionic activating mode, as well as in spermatozoa of euryhaline fishes, to various environmental conditions. We showed that alteration of environmental osmolality might affect the fish sperm in different ways, depending on fish species and modes of spermatozoa motility activation either osmotic or ionic mode. In response to osmotic stress caused by hypotonicity, carp spermatozoa regulated the flow of water across their cell membrane and increased their cytoplasmic volume during their short motility period. In contrast, no indications of sperm volume changes were observed neither in sterlet nor in brook trout spermatozoa, both of which having an ionic mode of motility activation. We also examined the mechanism by which sperm motility triggering in euryhaline fishes can adapt to a broad range of environmental salinity. Our results demonstrated that spermatozoa of euryhaline tilapia, Sarotherodon melanotheron heudelotii, reared in fresh-, sea- or hypersaline water can be activated in hypotonic, isotonic or hypertonic conditions of swimming milieu, provided Ca2+ ions are present at various levels. It was established that the higher the fish rearing salinity or the more hypertonic ambient media at spermatozoa activation, the higher extracellular concentration of Ca2+ ions is required. The results obtained in the present study allow suggesting that osmolality is not the main factor inhibiting sperm motility inside the testis in the S. melanotheron heudelotii. A third aim of this study was investigation of the regulation of motility initiation process and description of flagellar beating initiation in chondrostean spermatozoa. We detected that K+ inhibition of sperm motility in sturgeon can be by-passed due to the pre-exposure of sperm cells to a high osmolality shock prior to its transfer to K+-rich swimming media. Thus, we hypothesized that sturgeon spermatozoa may be activated by use of an unexpected signaling pathway, independent from regular ionic stimulation. The successive activation steps in sturgeon spermatozoa were investigated by high-speed video microscopy, using specific experimental situation, where sperm motility initiation was delayed in time up to several seconds. At motility initiation, the first couple of bends formed at the basal region begins to propagate towards the flagellar tip, but gradually fades when reaching the mid-flagellum. This behavior repeats several times until a stage where the amplitudes of bends gradually reach similar value, what eventually leads to sperm progressive displacement. The total period needed for the flagellum to switch from immobility with rigid shape to full activity with regular propagating bends ranges from 0.4 to 1.2 seconds. In conclusion, the results of the current study bring valuable pieces of information into the general understanding of the processes of maturation of fish spermatozoa, their adaptability to different physical and biochemical circumstances, the extra- and intra-cellular signaling as well as the regulatory mechanisms of motility activation in fish spermatozoa.

Keywords

rybí sperma, dozrávání spermatu, iniciace motility, pohyby bičíku, osmolality, objemové změny spermie, euryhalinní ryby

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 8. 9. 2016

Thesis defence

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery