Možnosti ovlivnění kvality prasečích oocytů vybranými suplementy kultivačníh media

Ing. David Němeček

Disertační práce

The effect of selected cultivation media supplements on the quality of porcine oocytes

Anotace:

Úspěšnost metod reprodukčních biotechnologií a asistované reprodukce je závislá na kvalitě oocytů. Používané in vitro metody jsou charakteristické zvýšeným působením stresorů, které se následně projeví na snížené kvalitě oocytů. V tuto chvíli je nereálné plné napodobení in vivo podmínek v in vitro a z toho důvodu je snaha využití jiných možností za účelem udržení kvality oocytů. Perspektivní metodou je suplementace kultivačního média. Vzhledem ke skutečnosti, že důležitým negativním faktorem v in vitro podmínkách je zvýšený oxidativní stres, může suplementace kultivačního média látkami s antioxidační aktivitou zvýšit kvalitu oocytů. Pozitivní efekt na kvalitu oocytů může mít rovněž modulace signálních drah, přičemž perspektivními molekulami jsou gasotransmitery. Na somatických buňkách a částečně i na oocytech je totiž prokázáno, že gasotransmitery mohou působit antiapoptoticky a podílí se na zvýšení životaschopnosti buněk. Z těchto důvodů jsme se zaměřili na vliv suplementace kultivačního média S-allyl cysteinem (SAC) a donorem oxidu uhelnatého (CO), jakožto látek s antioxidačními a antiapoptotickými vlastnostmi, na kvalitu meioticky zrajících a stárnoucích prasečích oocytů.Efekt suplementace kultivačního média donorem CO na stárnoucí prasečí oocyty jsme sledovali na základě posouzení morfologických znaků stárnutí a aktivity kaspazy-3 (marker zahájení apoptotického rozpadu). Zjistili jsme, že kultivace stárnoucích oocytů v kultivačním médiu obsahujícím donor CO vede ke snížení podílu apoptotických oocytů a současně ke zvýšení podílu intaktních oocytů. Zároveň donor CO výrazně snížil míru aktivace kaspázy-3. Na základě získaných dat předpokládáme, že suplementace kultivačního média donorem CO může zpomalit proces stárnutí prasečích oocytů a zvýšit jejich životaschopnost.Současně jsme sledovali vliv suplementace kultivačního média donorem CO na průběh meiotického zrání. Kultivace meioticky zrajících oocytů v přítomnosti CO vedla k zastavení meiotického zrání ve stádiu metafáze I. Na druhou stranu donor CO snížil množství reaktivních forem kyslíku (ROS) v oocytech. Na základě dosud získaných výsledků předpokládáme, že donor CO může v meioticky zrajících oocytech snížit oxidativní stres, ale současně inhibuje samotný průběh meiotického zrání.SAC je česnekovou sloučeninou, která má výrazné antioxidační vlastnosti a současně má schopnost uvolňovat gasotransmiter sulfan a aktivovat cytoprotektivní enzym hemoxygenáza, zodpovědný za endogenní produkci CO. Efekt suplementace kultivačního média SAC u meioticky zrajících oocytů vedl k výraznému snížení produkce ROS. Současně SAC zlepšil časný embryonální vývoj, neboť zvýšil míru rýhování embryí vzniklých po partenogenetické aktivaci. Zároveň předpokládáme, že meiotické zrání v přítomnosti SAC zvýšilo antioxidační potenciál embryí, protože embrya vzniklá po partenogenetické aktivaci vykazovala sníženou produkci ROS. Z těchto důvodů považujeme SAC jako perspektivní suplement kultivačního média, který zlepšuje vývojový potenciál a působí antioxidativně.Na základě získaných výsledků lze CO a SAC, považovat jako látky schopné zvýšit nebo udržet kvalitu prasečích oocytů.

Abstract:

The success of reproductive biotechnology and assisted reproduction methods depends on the quality of oocytes. The used in vitro methods are characterized by an increased rate of stress, which subsequently results in decreased oocyte quality. At this time, it is unrealistic to fully mimic in vivo conditions to in vitro, and therefore is the effort to explore other options in order to maintain the oocytes quality. A prospective method is the culture medium supplementation. Due to the fact that increased oxidative stress is an important negative factor in in vitro conditions, supplementation of the culture medium with substances with antioxidant activity may enhance oocytes quality. Modulation of signaling pathways may also have a positive effect on oocytes quality, while promising molecules are gasotransmitters. On somatic cells and partly on oocytes, it has been shown that gasotransmitters may have an antiapoptotic effect and contributes to the increase in cell viability. For these reasons, we have focused on the effect of S-allyl cysteine (SAC) and carbon monoxide (CO) donor as substances with antioxidant and antiapoptotic properties on the quality of meiotically maturing and aging porcine oocytes.The effects of CO donor on porcine oocytes aging was assessed based on the morphological characteristics and caspase-3 activity (apoptotic marker). We have found that cultivation of aging oocytes in culture medium containing CO donor leads to a reduction in the proportion of apoptotic oocytes and to an increase in the proportion of intact oocytes. At the same time, the CO donor significantly reduced the caspase-3 activation. On the basis of the obtained data, we suppose that the supplementation of the culture medium with the CO donor may slow the aging of porcine oocytes and increase their viability.We also evaluated the effect of the CO donor on the meiotic maturation of the porcine oocytes. Oocyte meiotic maturation in the presence of CO led to the meiotic maturation arrest in the metaphase I stage. On the other hand, the CO donor reduced the amount of reactive oxygen species (ROS) in oocytes. Based on the results obtained so far, we assume that the CO donor may reduce oxidative stress in meiotically matured oocytes, but it also inhibits the meiotic maturation process.SAC is a garlic compound that has pronounced antioxidant properties and has the ability to release the gasotransmitter sulfane and activate the cytoprotective enzyme hemoxygenase, which is responsible for endogenous CO production. The effect of SAC supplementation of the culture medium on meiotic maturation resulted in a significant reduction in ROS production. Simultaneously SAC improved early embryonic development, because it increased the cleavage rate of parthenogenetic activated oocytes. At the same time, meiotic maturation in the presence of SAC increased the antioxidant potential, because embryos resulting from parthenogenetic activation showed reduced ROS production. For these reasons we consider SAC as the perspective culture medium supplement which improve the developmental potential and reduce oxidative stress.Based on the obtained results we can consider CO and SAC as a substances capable of increasing or maintaining the quality of porcine oocytes.

Klíčová slova

oocyt, oxid uhelnatý, hemoxygenáza, S-allyl cystein, meiotické zrání, stárnutí, in vitro, kultivační médium, suplementace, prase

Keywords

heme oxygenase, S-allyl cysteine, meiotic maturation, aging, in vitro, culture medium, supplementation, pig, oocyte, carbon monoxide

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 18. 5. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. Ing. Mgr. Markéta Sedmíková, Ph.D.
• Oponent: Michal Ješeta, externi, Marie Machatková, externi, Miloslava Lopatářová, externi

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Doktorský studijní program / obor:
Zootechnika / Obecná zootechnika