Molekulární charakterizace genomu exfoliatin A konvertujících bakteriofágů

Mgr. Pavla Holochová, PhD.

Doctoral thesis

Molecular charakterization of an exfoliatin A-converting bacteriophage genome

Anotácia:

Bakteriální druh Staphylococcus aureus je významný patogen, který je již dlouhou dobu znám jako původce závažných onemocnění i život ohrožujících infekcí u lidí i zvířat. U 30 % zdravé populace tvoří součást běžné mikroflóry a vyskytuje se hlavně na nosní sliznici a kůži. Přibližně 5 % kmenů S. aureus produkuje exfoliativní toxiny (ET), které jsou příčinou kožních epidermolýz, jako je lokalizovaná forma Bullous impetigo, nebo generalizovaná forma tzv. stafylokokový syndrom opařené kůže. Tato onemocnění se vyskytují převážně u novorozenců na porodnických odděleních. Exfoliativní toxin A (ETA) je kódován genem eta, obsaženém v genomu mírného bakteriofága, který je integrován do chromozomu hostitelské bakterie a v ní perzistuje ve formě profága. Fágy S. aureus se řadí mezi mobilní genetické DNA elementy, které se mohou šířit mezi bakteriemi. Viry, které obsahují geny pro faktory virulence, mají schopnost tyto geny horizontálně přenášet mezi stafylokoky, čímž přispívají ke vzniku patogenních kmenů, zvyšují genetickou diverzitu druhu a dynamicky působí na jeho evoluci. Kromě exfoliativních toxinů produkuje S. aureus řadu dalších toxických exoproduktů, které se vyznačují superantigenní aktivitou. Jsou to zejména stafylokokové enterotoxiny (SEs), které u lidí způsobují stafylokokové otravy z potravin (SFP; staphylococcal food poisoning). Mezi enterotoxiny s emetickou aktivitou patří stafylokokový enterotoxin H (SEH), jehož gen je lokalizován na chromozomu, a způsobuje asi v 5 % případů stafylokokovou otravu u lidí. Kromě schopnosti vyvolávat emetické projevy, má také superantigenní vlastnosti. SEH-pozitivní kmeny S. aureus jsou v této práci uvedeny z důvodu mého výzkumného podílu na jejich genotypizaci. Při řešení cílů disertační práce byly dosaženy výsledky, které významně přispívají k detailní molekulární charakterizaci eta-pozitivních kmenů S. aureus a jejich fágů zodpovědných za hromadné výskyty stafylokokových epidermolýz na porodnických odděleních nemocnic v České republice a na Slovensku. Nově byla navržená multiplex PCR metoda, která potvrdila, že ETA-konvertující fágy tvoří heterogenní skupinu bakteriofágů, z nichž některé nebyly dosud popsány. Srovnávací analýzou sekvencí genomů fágů izolovaných z klinických kmenů bylo zjištěno, že šíření genu eta a konverzi produkce exfoliativního toxinu A u S. aureus zprostředkovávají geneticky různé fágy, které se svými fenotypovými vlastnostmi podobají fágům klasifikovaným do čeledi Siphoviridae a serologické skupiny B. V této disertační práci jsou rovněž uvedeny výsledky molekulární charakterizace 28 SEH-pozitivních kmenů S. aureus, izolovaných z potravin a surovin živočišného původu, genotypizačními metodami, na kterých jsem se výzkumně podílela.

Abstract:

Staphylococcus aureus is a common bacterial pathogen causing various diseases and life affecting infections in people. Generally, in 30 % healthy population it colonizes mainly nasal mucosis and skin. About 5 % of S. aureus strains are able to produce the exfoliative toxins (ETs), which are the cause of skin disorders known as localized form Bullous impetigo, or generalized form Staphylococcal Scalded Skin Syndrome. These diseases predominantly affect the newborns in maternity hospitals. The exfoliative toxin A (ETA) is coded by the eta gene located on a prophage that is integrated into the S. aureus chromosome. The phages harboring the eta gene belong to the mobile genetic elements transferred between cells. They contribute to development of the pathogenic strains; enhance the diversity and evolution dynamics of the S. aureus. In this work we have analyzed the four eta gene-positive bacteriophages,which were isolated by UV radiation from clinical ETA-producing strains selected from a set of 101 ET-positive S. aureus strains. Our results indicate that eta-gene positive phages that morphologically resemble the phages of the family Siphoviridae seem to be the efficient mediators of the eta gene horizontal transfer among the S. aureus strains. Additional, we found that different ETA-converting phages broadly persist as prophages in the S. aureus strains occurring in the Czech and Slovak maternity hospitals. We developed a single-reaction multiplex PCR assay for rapid and specific detection of various eta gene-positive prophages of serogroup B responsible for dissemination of the eta gene and ETA production in clinical strains. This PCR strategy enabled to classify the ETA-positive strains into six groups. This novel PCR strategy is reliable in the rapid identification of yet undescribed ETA-converting B prophages, differentiation of the closely related ETA-positive strains and is a convenient tool for hospital epidermolytic infection control. In this work, I also present the results of characterization of SEH-producing S. aureus strains by genotyping methods, on which I exploratively participated.

Kľúčové slová

Staphylococcus aureus, Exfoliativní toxin A, Stafylokokový syndrom opařené kůže, Pemphigus neonatorum, Fágová lyzogenní konverze, Profágy, Horizontální přenos genů, Fágové sekvence, Multiplex PCR, Stafylokoková otrava jídlem, Stafylokokový enterotoxin H, Polymorfizmus stafylokokového proteinu A

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 5. 3. 2010

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 30. 4. 2010
• Vedúci: doc. RNDr. Vladislava Růžičková, CSc.
• Oponent: prof. MUDr. David Šmajs, Ph.D., doc. MUDr. Petr Lány, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / odbor:
Biology (4-years) / Molecular and Cellular Biology