Novel approaches towards electroanalysis of natural and modified DNAs and their interactions

Mgr. Jan Špaček, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Tato disertační práce obsahuje komentáře šesti odborných prací publikovaných v impaktovaných elektroanalytických časopisech a zmiňuje dva dosud nepublikované projekty. Předkládané výsledky prezentují nové poznatky o elektrochemii přirozené a modifikované DNA, včetně nových aplikací. (1) Nová metod umožňující studium DNA-protein interakcí, nazvaná elektrochemický „footprinting“, je založená na reakci mezi enzymaticky zařazenou bází značenou azidofenylovou skupinou a fenyl- nebo nitrofenylacetylénem. Tato „click“ reakce nemůže proběhnout v případě, že je azidofenylem modifikovaná báze překrytá DNA-vázajícím proteinem. Z rozdílu mezi signály poskytovanými značkami před a po „click“ reakci je možno odvodit informace o interakci DNA a proteinu. (2) Byla vyvinuta nenákladná technika pro rychlou detekci přítomnosti PCR produktů. Metoda je založená na enzymatické inkorporaci cytosinu značeného biotinem během PCR. Analýza přítomnosti PCR produktu (a tedy zprostředkovaně hledané sekvence ve vzorku) je prováděna nepřímo pomocí detekce elektrochemicky aktivního produktu enzymatické reakce. Tento produkt vzniká konverzí substrátu na elektroaktivní produkt enzymem, který je při analýze přítomen jen tehdy, je-li na povrchu elektrody přítomna DNA obsahující biotinu. (3) Elektrochemické vlastnosti DNA byly studovány i v případě DNA s modifikovanými bázemi. Byla provedena detailní analýza elektrochemických a optických vlastností PCR produktů obsahujících 7-deaza puriny. Bylo zjištěno, jakým způsobem tyto modifikace ovlivňují elektrochemické chování a stabilitu duplexu DNA na povrchu rtuťové elektrody a v roztoku. (4) S pomocí elektrochemických a fluorescenčních metod byla zkoumána interakce PCR produktů modifikovaných 7-deaza puriny s fluorescenčním barvivem SYBR green I. Získané výsledky potvrdily, že 7-deazaguanin zháší fluorescenci barviva SYBR green I mechanismem pravděpodobně zahrnujícím DNA zprostředkovaný přenos náboje. (5) Byly popsány nové signály poskytované bázemi DNA na povrchu elektrod z pyrolytického uhlíku. Tato práce ukazuje, že i na povrchu uhlíkových elektrod je možné provádět elektroredukci bází DNA, kterou bylo možno dříve pozorovat pouze na elektrodách na bázi rtuti. Tato práce popisuje mnoho nových oxidačních signálů vzniklých po předchozí redukci analyzované DNA, nebo naopak nové signály vznikající redukcí elektrochemicky oxidovaných bází. (6) Dvoukroková příprava DNA modifikované komplexy oxidu osmičelého je založena na enzymatické inkorporaci butylakrylátem značených nukleotidů do DNA a jejich následné chemické modifikaci komplexy oxidu osmičelého. Na závěr je zmíněna experimentálně potvrzená možnost kvantitativní analýzy přítomnosti nepřirozených bází v plazmidech izolovaných ze semi-syntetických organismů a je diskutována definice života.

Abstract:

This dissertation includes commentary of six studies published in electroanalytical peer reviewed journals and mentions two yet unpublished projects. Presented results provide new insights on electrochemistry of natural and modified DNA, including new analytical applications. (1) A new method of electrochemical analysis of DNA-protein interactions, named electrochemical “footprinting”, has been developed. The method is based on the reaction between site specific enzymatically introduced azidophenyl-modified bases and phenyl- or nitrophenylacetylene. When sequences containing the azidophenyl modifications are covered by DNA-binding protein, reaction with phenyl- or nitrophenylacetylene cannot occur. Information about DNA-protein interaction can be deduced from the difference between the signals of DNA labels before and after click reaction. (2) Simple, low cost and fast protocol for detection of PCR products is presented. The method is based on incorporation of biotin labeled cytosine during the PCR, presence of which is manifested by detection of an electrochemically active product of enzymatic reaction. This product is converted from electrochemically inactive substrate by a streptavidin coupled enzyme, which is available only if the PCR product containing biotin labels is present on the electrode surface. (3) Aside from fully natural DNA, properties of DNA with modified bases were analyzed. We studied electrochemical and optical activity of PCR products with polymerase-introduced 7-deaza purine bases. The study has shown how substitution of N7 by C in 7-deazapurines affect stability of the DNA structure on the electrode surface and it the solution. (4) Interactions of 7-deaza purine PCR products with florescent dye SYBR green I were studied using fluorescence in solution and electrochemistry on the surface of the pyrolytic graphite electrode. Obtained results has confirmed previous hypothesis that 7-deazaguanine quenches fluorescence and our results suggested that SYBR green I quenching can happen from remote sites by mechanism involving DNA-mediated charge transfer. (5) Newly discovered DNA signals provided by DNA bases on the surface of the pyrolytic graphite electrode were presented. It has been shown that electroreduction of DNA bases is possible on the carbon electrodes; behavior previously observed only on mercury based electrodes. This study also shows new oxidation signals which could be “switched on” by prior reduction of the DNA bases and vice versa new reduction signals obtained by prior electrooxidation. (6) Two step redox labeling of DNA through enzymatic introduction of butylacrylate base modified nucleotides, followed by reaction with osmium tetroxide complex is presented. Experimentally proven possibility of quantitative electroanalysis of unnatural base pairs in plasmids isolated from semi-synthetic organism is mentioned and definition of life is discussed.

Keywords

Electrochemistry, DNA, DNA labeling, carbon electrode, mercury electrode

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 4. 2018

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 8. 6. 2018
• Vedoucí: Mgr. Luděk Havran, Dr.
• Oponent: doc. Ing. Jan Vacek, Ph.D., doc. RNDr. Vlastimil Vyskočil, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie (čtyřleté) / Genomika a proteomika