Příprava a charakterizace buněčných linií geneticky editovaných pomocí CRISPR/Cas9 systému

Bc. Pavel Kopčil

Master's thesis

Generation and characterization of cell lines genetically engineered through the CRISPR/Cas9 system

Abstract:

V současné době dominující systém CRISPR/Cas9, sloužící primárně prokaryotickým buňkám jako forma adaptivní imunity, přinesl do světa molekulární biologie a genetiky doslova revoluci. V porovnání s ostatními dostupnými editačními nástroji vykazuje jednoznačně jednodušší manipulaci a větší aplikační potenciál. Je používán jako základní nástroj k editacím a manipulacím s DNA i RNA, ke změnám genové exprese i k dalším aplikacím na úrovni funkční genomiky, modelování chorob nebo genových terapií. Cílem diplomové práce bylo použití metody CRISPR/Cas9 k přípravě, verifikaci a ustanovení T buněčných knockout linií Jurkat pro RASAL3 genu a za použití funkčních testů (měření toku vápenatých iontů, buněčného cyklu a detekce změn hladin fosforylovaných proteinů zapojených v TCR signalizaci) analyzovat změny, které vyřazení tohoto genu z funkce způsobilo. Dále byly studovány knockout CD20 linie Mec1 a Ramos k poznání funkce molekuly CD20.

Abstract:

CRISPR/Cas9 technology, derived from prokaryotic cells, recently dominates in the field of gene editing in all kinds and types of the cells. In comparison with other available editing tools it evinces conclusively much easier manipulation and wider application potential. It is used as a basic tool for editing both DNA and RNA sequences, for altering gene expression and more complex and sophisticated application in functional genomics, diseases modeling and gene therapy. The main aim of this diploma thesis is to generate and verificate Jurkat RASAL3 deficient T cell line and then by using functional tests (calcium flow, cell cycle and detection of phosphorylation patterns in TCR signaling proteins) describe this novel protein of the RasGAP family. In the same fashion CD20 molecule is studied in previously established Mec1 and Ramos B cell lines

Keywords

CRISPR, Cas9, NHEJ, CD20, vápník, buněčný cyklus, RASAL3, Ras, GAP, TCR, calcium, cell cycle

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 10. 5. 2018

Thesis defence

• Date of defence: 21. 6. 2018
• Supervisor: Mgr. Michal Šmída, Dr. rer. nat.
• Reader: doc. Mgr. Petr Beneš, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Medical Genetics and Molecular Diagnostics