Optimalizace rozmrazovacích protokolů u kryokonzervovaného beraního spermatu plemene valašská ovce

Bc. Kristýna Zemanová

Master's thesis

Optimizing thawing procedures of cryo-conserved ram sperm in Wallachian sheep breed

Abstract:

Cílem diplomové práce byla analýza kvalitativních parametrů kryokonzervovaného beraního spermatu (Valašské ovce) v závislosti na použití různých rozmrazovacích protokolů. S ohledem na horší mrazitelnost inseminačních dávek u beranů, je důležité optimalizovat jak mrazitelnost, tak i rozmrazení dávek, aby bylo možné zachovat co nejlepší kvalitu spermatu pro následnou inseminaci. Inseminační dávky pro tuto práci byly získány od dvou beranů výše uvedeného plemene. Ejakulát byl odebrán vždy od obou beranů, a poté byly oba vzorky smíchány a naředěny ředidlem AndroMed. Inseminační dávky byly mrazeny v polystyrenovém mobilním mrazicím boxu, kde bylo možné kontrolovat výšku vzorků nad hladinou tekutého dusíku, a tím regulovat mrazící křivku. Rozmrazení probíhalo při teplotách 45, 50, 55 a 65 °C v intervalech 2, 5, 8, 11 a 14 sekund. Všechny naměřené hodnoty byly porovnány se standardem, který byl rozmrazen při 38 °C po dobu 30 sekund. Dle vyhodnocených dat, které byly vyhodnoceny v této diplomové práci bylo potvrzeno, že rozdílné teplotní gradienty a doba při rozmrazování inseminačních dávek má vliv na kvalitativní parametry spermií. Pro tuto práci byly stanoveny hlavní kvalitativní parametry a to: viabilita, mitochondriální membránový potenciál, motilita a progresivní motilita. Naměřené hodnoty při teplotě 45 °C se dle statistického vyhodnocení nejvíce blížily výsledkům standardu. Vyšší teploty 60 a 65 °C v kratším časovém úseku rozmrazení měly dle průtokové cytometrie lepší hodnoty než standard, avšak dle statistického vyhodnocení nebyly statisticky významné. Metoda CASA navíc odhalila u těchto teplot narušení progresivní motility, což snižuje potenciál spermatických buněk pro oplodnění vajíček. Pro praktické využití v chovu hospodářských zvířat je nejlepší využití standardní metody, kdy probíhá rozmrazení při 38 °C. V externích podmínkách by bylo použití jiných teplot složitější z hlediska dosažení přesné teploty a času.

Abstract:

The present work aimed to analyze the qualitative parameters of cryopreserved Wallachian ram sperm depending on the use of various thawing protocols. Given the poorer freezing tolerance of insemination doses in rams, it is important to optimize both freezing and thawing protocols to maintain the best semen quality for subsequent artificial insemination. The insemination doses for this work were obtained from two mature healthy Wallachian rams with the use of an artificial vagina. On each semen collection day, ejaculates were collected from both rams, then both samples were mixed and diluted with commercial semen diluent AndroMed. Only good quality sperm was used for the insemination doses processing. Processed insemination doses were frozen by a protocol previously optimized for Wallachian ram sperm cryopreservation. Thawing of insemination doses took place at temperatures of 38, 45, 50, 55, or 65 °C at intervals of 2, 5, 8, 11, 14, or 30 seconds. According to the obtained results, it was confirmed that various temperature gradients during the thawing of insemination doses affect the post-thaw quality of sperm. For this work, the main qualitative parameters were determined with the use of flow cytometry and CASA: viability, mitochondrial membrane potential, mobility, and progressive mobility. All measured values were compared with a standard thawing protocol (38 °C for 30 seconds). Obtained results can be described shortly as follows: according to the statistical evaluation, the standard protocol of thawing is the optimal protocol to thaw Wallachian ram sperm. Only measured values at 45 °C turned out to be the closest to the results of the standard. Higher temperatures of 60 and 65 °C with a shorter thaw time had numerically better values compared to the standard according to flow cytometry data, but they were not statistically significant by statistical evaluation. Furthermore, the CASA method revealed a progressive impairment of motility at higher temperatures, which reduces the ability of spermatozoa to fertilize eggs. In conclusion, for practical use, I recommend using the standard method, as in outdoor conditions, using other (especially higher) temperatures would be more difficult in terms of achieving accuracy, and, therefore, unsafe for sperm cells.

Keywords

průtoková cytometrie, CASA, inseminační dávka, ovce, spermie

Keywords

flow cytometry, CASA, insemination dose, sheep, sperm

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 4. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 17. 5. 2023
• Supervisor: Ing. Filipp Georgijevič Savvulidi, Ph.D.
• Reader: Andrea Svoradová, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme:
Animal Production