Analysis of SMC5-6 complex subunits and their functional homologs

Marc Guérineau, M.Sc.

Disertační práce

Anotace:

U většiny organizmů, SMC proteiny (structural maintenance of chromosomes) regulují replikaci chromosomů, jejich kondenzaci, kohezi, segregaci a opravy DNA. V eukaryontních buňkách zajišťují kohesin a kondensin, dva z SMC komplexů, kohezi a kondenzaci chromozomů během mitózy. Třetí komplex – SMC5-6 komplex – se podílí na segregaci a procesech oprav DNA. Obsahuje subkomplex složený ze tří ne-SMC elementů, Nse1-Nse3-Nse4. Nse3 je kvasinkový ortolog lidského hNSE3-MAGEG1, prvního z objevených proteinů MAGE, který dal název celé skupině savčích MAGE proteinů. Nse4 je příbuzný s rodinou savčích EID (E1A-like Inhibitor of Differentiation) proteinů. Předchozí studie ukázaly, že interakce mezi Nse3 a Nse4 odpovídá evolučně zakonzervovaným interakcím mezi skupinou proteinů MAGE a EID. Za použití protein-proteinových interakčních technik jako in vitro pull-down nebo kvasinkový dvojhybridní systém je v této práci identifikován region zodpovědný za vazbu Nse4 k Nse3 a Nse1. Podle svého působení byly pojmenovány dvě domény – Nse3/MAGE vazebná a Nse1 vazebná doména. Zjistili jsme, že Nse-1 vazebná doména se s Nse3/MAGE vazebnou doménou překrývá, ale Nse1 a Nse3 si vzájemně ve vazbě nekonkurují. Nse3/MAGE vazebná doména obsahuje evolučně konzervovaný hydrofóbní motif, který zprostředkovává vazbu nezi hNSE4b a hNSE3/MAGEG1. Dále jsme otestovali fragmenty dalších proteinů EID rodiny, které obsahovaly homologní motiv k Nse4, a pozorovali jsme jejich vazbu na většinu MAGE proteinů, což naznačuje, že je tato doména zachovalá u všech EID proteinů. Nicméně vazebná afinita EID hydrofóbního motivu je rozlišná mezi MAGE proteiny typu I a II. Zjistili jsme, že malý aminokyselinový fragment necházející se vedle N-konce hydrofobického motivu je nezbytně nutný pro stabilizaci interakce s MAGE proteiny I. typu. Navíc jsme pozorovali, že MAGEC2 soutěží s EID2 o vazbu na koaktivátor transkripce p300, což naznačuje, že MAGE proteiny mohou blokovat vazbu proteinů EID k CBP/p300 a tím zabránit, aby inhibovaly transkripci. Tyto výsledky přinášejí nový vhled do interakcí MAGE-EID, jejich evoluce a funkce.

Abstract:

In most organisms, the structural maintenance of chromosomes (SMC) proteins regulate the chromosome replication, condensation, cohesion, segregation and DNA repair. In eukaryotes, cohesin and condensin, two SMC complexes, ensure chromosome cohesion and condensation during mitosis. The third SMC complex, the intriguing SMC5-6 complex, is involved in segregation and DNA repair processes. It contains a subcomplex formed by three non-smc-elements, Nse1-Nse3-Nse4. Nse3 is the yeast ortholog of the human hNSE3/MAGEG1, founding member of the mammalian MAGE protein superfamily. Nse4 is related to the mammalian EID (E1A-like Inhibitor of Differentiation) protein family. A previous study has shown that the Nse3-Nse4 interaction is evolutionary conserved between mammalian MAGE and EID proteins. In this thesis, using protein-protein interaction techniques (like in vitro pull-down or yeast-two-hybrid) and molecular modelling, the amino acid regions of Nse4 responsible for the binding to Nse3 and Nse1 were identified, called respectively the Nse3/MAGE-binding and the Nse1-binding domains. We found that the Nse1-binding domain overlaps with the Nse3/MAGE-binding domain, but that Nse1 does not compete with Nse3 for binding to Nse4. The Nse3/MAGE-binding domain contains a hydrophobic motif which is conserved in humans and mediates the binding between hNSE4b and hNSE3/MAGEG1. Further, we have tested fragments of the other EID family members, homologous to the Nse4 hydrophobic motif, and observed that they bind to most MAGE proteins, suggesting that this domain is conserved within all EID members. However, the binding affinity of the EID hydrophobic motif differs between the type I and type II MAGE proteins. We have found that an extra polar/charged amino acid fragment, located behind the N-terminal end of the hydrophobic motif, is necessary for stabilizing the interaction with the MAGE type I proteins. In addition, we have observed that MAGEC2 compete with EID2 to bind the general co-activator of transcription p300, suggesting that the MAGE proteins may block the EID proteins binding to CBP/p300 and may relieve their transcriptional inhibitory effects. These results bring new insights into the MAGE-EID interactions, evolution and function.

Keywords

SMC5-6, Nse1-Nse3-Nse4, MAGE, EID, RING, p300, protein-protein interactions, PEPSCAN ELISA

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 5. 3. 2013

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 26. 4. 2013
• Vedoucí: doc. Mgr. Jan Paleček, Dr. rer. nat.
• Oponent: doc. RNDr. Fatima Cvrčková, Dr., doc. RNDr. David Honys, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie (čtyřleté) / Molekulární a buněčná biologie