Metody detekce velkých genových delecí u autozomálně dominantních onemocnění

Bc. Barbora Hrušťáková

Master's thesis

Methods for detection of large gene deletions in autosomally dominant diseases

Abstract:

Hereditární angioedém je autozomálně dominantní onemocnění, které je způsobeno mutací v genu pro C1 inhibitor (SERPING1), jež se projevuje sníženým množstvím funkčního proteinu v krevní plazmě a epizodickými otoky laryngeální a gastrointestinální sliznice a podkoží. V 80% případů stojí za vznikem onemocnění bodové mutace nebo malé delece či inzerce. Zbývajících 20% jedinců jsou nositelé velkých genových delecí či duplikací. Cílem této diplomové práce byla optimalizace metody vhodné k detekci velkých genových delecí či duplikací v genu pro C1-INH v podmínkách genetické laboratoře CKTCH v Brně a ověření možnosti jejího klinického využití při vyšetření pacientů s klinickými příznaky hereditárního angioedému. K tomuto účelu byla použita metoda mnohonásobné fluorescenční PCR podle protokolu Roche a kol. (2005), která byla zoptimalizována a použita k detekci velkých genových delecí v genu SERPING1 u skupiny 27 pacientů s klinickými příznaky onemocnění HAE. U souboru 22 jedinců, kteří byli v genetické laboratoři CKTCH již vyšetřeni na přítomnost bodových mutací, malých delecí či inzercí, a výsledek těchto analýz byl negativní, byla detekována u sedmi z nich velká genová delece v genu SERPING1. Byly to delece exonu 3, ve třech případech exonu 4, dále pak exonu 7 a delece postihující exony 1-6 a 1-8. U skupiny 5 pacientů byla prováděna souběžná analýza jak velkých genových delecí či duplikací, tak bodových mutací a malých delecí či inzercí. U třech z nich poukazoval neobvyklý fluorescenční profil fragmentační analýzy na přítomnost určité změny v nukleotidové sekvenci DNA. U dvou z nich byl tento předpoklad potvrzen sekvenací DNA, která odhalila přítomnost bodové mutace. Tato práce prokázala na vyšetření pacientů s klinickými příznaky HAE, že metoda mnohonásobné fluorescenční PCR je metodou dostatečně spolehlivou a citlivou k detekci velkých genových delecí v genu pro C1-INH a může být zavedena jako rutinní metoda v klinické diagnostice genetické laboratoře CKTCH v Brně.

Abstract:

Hereditary angioedema (HAE) is an autosomal dominant disease caused by defective gene SERPING1 coding for C1 inhibitor (C1-INH). It is characterized by low levels of functional C1-INH in blood plasma, resulting in episodic edemas of laryngeal and gastrointestinal mucous membranes and skin. Point mutations, small deletions or insertions are responsible for aproximatly 80% cases while remaining 20% cases are caused by large deletions or duplications. The aim of this study was an introduction of technique suitable for detection of large deletions or duplications in the SERPING1 gene in the Molecular genetics laboratory at Centre for Cardiovascular Surgery and Transplantation (CKTCH) in Brno, and validation of this method for clinical use in patients with clinical diagnosis of HAE. To this intention, multiplex fluorescent PCR according to protocol by Roche et al. (2005) was optimized and used, detecting large deletions or duplications in SERPING1 gene in 27 patients with clinical symptoms of HAE disease. There were 22 individuals, who were previously screened for point mutations and small deletions or insertions in the genetic laboratory, and these analysis were negative. 7 of them were carriers of large gene deletion in SERPING1 gene. Those were: deletion of exon 3, three cases of exon 4 deletion, deletion of exon 7 and deletions of exons 1-6 and 1-8. 5 individuals were simultaneously screened for point mutations and small deletions or insertions as well as large gene deletions or duplications. Three of them had abnormal fluorescent profile after fragmentation analysis that pointed at some changes in the nucleotide DNA sequence. Sequencing of DNA detected point mutations in two of these cases. This study has showen by examinating patients with clinical symptoms of HAE the reliability and sensitivity of multiplex fluorescent PCR for detection of large gene deletions or duplications in C1-INH gene and could be introduced as routine technique of clinical diagnosis in the genetic laboratory at CKTCH Brno.

Keywords

hereditární angioedém, C1 inhibitor, Multiplex fluorescent PCR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 18. 5. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 23. 6. 2009
• Supervisor: doc. MUDr. Tomáš Freiberger, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biology / Molecular Biology and Genetics