Porovnání vlivu rychlosti chlazení a mrazení na kvalitu inseminační dávky hospodářských zvířat

Pavla Pokorná

Master's thesis

Comparison of the effect of cooling and freezing rate on the quality of the insemination dose of livestock

Abstract:

Kryokonzervace gamet je klíčový krok v umělé inseminaci zvířat. U savců se daří optimalizovat mrazící protokoly a dosahuje se dostačujících výsledků. U ptáků stále není proces kryokonzervace spermií uspokojivě optimalizován. Je to způsobeno jejich odlišnou morfologickou stavbou. V práci byly porovnány odlišné výšky chlazení od hladiny tekutého dusíku a sledován vliv různých komerčních ředidel s přídavkem kryoprotektantu. Inseminační dávky byly tvořeny směsným vzorkem ejakulátů od čtyř kohoutů plemene česká slepice zlatá kropenatá. Plemeno je zařazeno na seznam genových zdrojů České republiky a jedná se o geneticky ohrožený druh. Kohouti byli chováni za stejných podmínek v pokusné a demonstrační stáji při ČZU v Praze. Před a po zamrazení byla u spermií změřena celková mobilta na mCASA (iSperm, Aidmics Biotechnology Co., Ltd., Taipei, Thaiwan). Životnost spermií (PMI), celistvost plazmatické membrány (PMD), akrozomální poškození (ACRD) a dvojí poškození spermií (poškození plazmatické membrány i akrozomu) (PAD) bylo měřeno pomocí průtokového cytometru (Novocyte 3000, Acea Biosciences). V prvním experimentu se hodnotil vliv výšky chlazení na funkční parametry spermií. Vybrány byly tři výšky – 3,5 cm, 5,0 cm a 7,5 cm. Celková motilita po rozmrazení byla nejvyšší u výšky 5,0 cm. Nejhorší funkční parametry vykazovaly spermie při chlazení na výšce 7,5 cm. Z měřených parametrů bylo nejvíce ovlivněné dvojí poškození spermií. Naopak nejméně bylo ovlivněno poškození akrozomu. V druhém experimentu se hodnotil vliv přídavku tří různých ředidel (Poultry media®, Raptac® a NeXcell®) s přídavkem 9% kryoprotektantu N-methylacetamid (NMA). Dále se hodnotil vliv teploty při rozmrazení (5 °C/100 sekund a 40 °C/30 sekund). Celková motilita byla na hladině významnosti p <0,0001 nejvyšší u ředidel Poultry media® a Raptac®. Nejhorší výsledky byly u použití ředidla NeXcell® (p <0,05). PMD bylo na hladině významnosti p <0,0001 nejvyšší u ředidla NeXcell®, ACRD dosahovalo na hladině významnosti p <0,0001 nevyšších hodnot u ředidla Poultry media® a PAD bylo na hladině významnosti p <0,0001 nevyšší u ředidla NeXcell®. Různé teploty při rozmrazení neměly statisticky významný vliv na sledované parametry spermií. Jako nejvhodnější postup kryokonzervace kohoutích spermií bylo vyhodnoceno použití ředidla Poultry media® nebo Raptac® s 9 % NMA a chlazení 3,5 cm od hladiny tekutého dusíku. Nejméně vhodné se ukázalo ředidlo NeXcel® a výška chlazení 7,5 cm. Nicméně je nutné brát v potaz individualitu chovných jedinců i rozdíly mezi odběrovými dny.

Abstract:

Cryopreservation of gametes is a key step in artificial insemination of animals. In mammals, freezing protocols are already being optimized and are achieving sufficient results. In avians, cryopreservation of sperm does not achieve nearly as good results. This is due to their different morphological structure of sperm. In this study different cooling heights from the level of liquid nitrogen were compared and the effect of different commercial diluents with the addition of cryoprotectant was investigated. The insemination doses were made up of a mixed sample of ejaculates from four roosters of the Czech golden speckled hen breed. The breed is included in the list of genetic resources of the Czech Republic and is a genetically endangered species. The roosters were kept under the same conditions in the experimental and demonstration barn at the ČZU in Prague. Sperm were measured for total motility on mCASA (iSperm, Aidmics Biotechnology Co., Ltd., Taipei, Thailand) before and after freezing. Sperm viability (PMI), plasma membrane damage (PMD), acrosomal damage (ACRD) and double damage (both plasma membrane and acrosome damaged) (PAD) were measured using a flow cytometer (Novocyte 3000, Acea Biosciences). In the first experiment, the influence of the cooling height on the functional parameters of the sperm was evaluated. We choose three heights – 3.5 cm, 5.0 cm and 7.5 cm. Total motility after thawing was highest at a height of 5.0 cm. The worst functional parameters of sperm were at height of 7.5 cm. Of the parameters measured, double damage was the most affected. On the contrary, acrosome damage was least affected. In the second experiment, the effect of the addition of three different diluents (Poultry media®, Raptac® and NeXcell®) with the addition of 9% cryoprotectant N-methylacetamide (NMA) was evaluated. Furthermore, the influence of temperature during thawing (5 °C/100 seconds and 40 °C/30 seconds) was evaluated. Total motility was the highest at the p <0.0001 significance level with Poultry media® and Raptac® diluents. The worst results were with the use of NeXcell® diluent (p <0.05). PMD was the highest at the p <0.0001 significance level with NeXcell® diluent, ACRD was the highest at the p <0.0001 significance level with Poultry media® diluent, and PAD was the highest at the p <0.0001 significance level with NeXcell® diluent. Different temperatures during thawing did not have a statistically significant effect on the observed sperm parameters. The use of Poultry media® or Raptac® diluent with 9% NMA and cooling 3.5 cm from the level of liquid nitrogen was found suitable procedure for cryopreservation of rooster sperm. The least suitable for us was NeXcel® and a cooling height of 7.5 cm. However, it is necessary to consider the individuality of the breeding individuals and the differences between sampling days.

Keywords

mrazící křívka, kryokonzervace, ředidla, průtoková cytometrie, ejakulát

Keywords

ejaculate, freezing curve, cryoconservation, extenders, flow cytometry

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 25. 4. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 15. 5. 2023
• Supervisor: Ing. Martina Janošíková, Ph.D.
• Reader: Ondřej Šimoník, externi

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / specializace:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology