Využití lights-on lights-off sond pro rozlišení variant viru SARS-CoV-2

Bc. Eva TARACKEZY

Master's thesis

Lights-on lights-off probes for genotyping of SARS-CoV-2

Abstract:

Pandemie onemocnění COVID-19 způsobeného virem SARS-CoV-2 ovlivnila celý svět a s jejími důsledky se společnost vyrovnává dodnes. Pro sledování evoluce viru a aktuálního stavu šíření v populaci je důležité určení sekvenčních variant SARS-CoV-2. Pro genotypizaci SARS-CoV-2 se využívá sekvenování, které je však ekonomicky, časově i personálně náročné. Druhým přístupem je cílené testování. Metody cíleného testování se snaží identifikovat jednu nebo více variant SARS-CoV-2. Metodou, která by spojovala výhodu rychlosti cílené genotypizace a šíři záběru sekvenování, se zabývá experimentální část této diplomové práce. Jedná se o Linear After The Exponential-PCR (LATE-PCR) s reverzní transkripcí s hybridizací se sondami lights-on/lights-off. V experimentální části práce byl proveden návrh primerů a lights on/lights-off sond, jejich testování se syntetickými standardy - DNA fragmenty genu pro S1 protein u SARS-CoV-2 a úspěšné ověření specifity vazby sond na amplikony reálných vzorků RNA SARS CoV-2. Na základě výsledků této práce bylo zjištěno, že tato metoda disponuje potenciálem odhalit všechny mutace v regionu vyhrazeném primery zleva a zprava. Srovnáním s databankou křivek tání jednotlivých variant SARS-CoV 2 by bylo možno určit konkrétní mutace přítomné ve vzorku a nové mutace by mohly být odhaleny podle nového profilu křivky tání a potvrzeny sekvenováním.

Abstract:

The pandemic of the disease COVID-19 caused by the SARS-CoV-2 virus has affected the entire world, and society is still coping with its consequences today. In order to monitor the evolution of the virus and the current state of spread in the population, it is important to determine the sequence variants of SARS-CoV-2. Sequencing is used for SARS-CoV-2 genotyping, but it is economically demanding, time-intensive, and personnel-intensive. The second approach is targeted testing. Targeted testing methods try to identify one or several variants of SARS-CoV-2. The experimental part of this diploma thesis deals with a method that would combine the advantage of the speed of targeted genotyping and the breadth of sequencing coverage. It is Linear After The Exponential-PCR (LATE-PCR) with reverse transcription with hybridization with Lights-On/Lights-Off probes. In the experimental part of the work, the design of primers and Lights-On/Lights-Off probes was carried out, their testing with synthetic standards - DNA fragments of the gene for the S1 protein in SARS-CoV-2 and the successful verification of the specificity of the binding of the probes to the amplicons of real RNA samples of SARS CoV-2. Based on the results of this work, it was found that this method has the potential to detect all mutations in the region reserved by the primers from the left and right. By comparing with a database of melting curves of individual SARS CoV 2 variants, it would be possible to determine the specific mutations present in the sample and new mutations could be detected according to the new melting curve profile and confirmed by sequencing.

Keywords

SARS-CoV-2, COVID-19, lights-on/lights-off sondy, LATE-PCR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 30. 4. 2024

Thesis defence

• Supervisor: prof. Mgr. Jiří Drábek, Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Molecular and Cell Biology / Molecular and Cell Biology