Metody uchování spermatu trubců včely medonosné: testování kvality uchovávaných spermií pomocí průtokové cytometrie.

Bc. Filipp Savvulidi

Master's thesis

Methods of storage of honeybee semen: evaluation of honeybee spermatozoa viability with flow cytometry.

Abstract:

Hodnocení kvality spermií je nezbytnou metodou pro efektivní uchovávání trubčího spermatu. V praxi se hodnotí životaschopnost spermií pomocí testů zaměřených na posuzování strukturální a funkcionální integrity jejich plazmatické membrány. Pro hodnocení strukturální (fyzikální) integrity membrány se používají specielní fluorescenční látky, které vnikají do vnitra poškozených buněk a obarvují jejích DNA. Reakce spermií na hypoosmotické prostředí (tzv. HOS test) se používá pro vyhodnocení funkcionální (biochemické) integrity membrán. Tyto testy jsou primárně založeny na technice mikroskopického pozorování. Mikroskopické techniky jsou časově náročné, subjektivní a nepřesné. Naopak, průtoková cytometrie (což je modifikace fluorescenční mikroskopie) je velice rychlá, plně automatická, objektivní a přesná. V dnešní době průtokové cytometry již přestávají být striktně vědeckými přístroji a velmi úspěšně jsou využívány v oboru reprodukce hospodářských zvířat (a to nejenom pro účel sexování sperma). Navzdory výhodám a velkému potenciálu průtoková cytometrie zatím není rutinní metodou ve včelařském vědeckém výzkumu. Zavedení průtokové cytometrie do běžné včelařské výzkumné praxe by bylo velmi přínosné a to hlavně pro vývoj žádoucí metodiky dlouhodobého uchovávání trubčího sperma. Cílem předložené práce je zavedení a optimalizace metody průtokové cytometrie pro účel rutinní hodnocení kvality trubčího spermatu. Pro tento účel jsem vyvinul jednoduchý test simultánního hodnocení strukturální a funkcionální integrity plazmatické membrány spermií za pomoci průtokového cytometru. Ve výše popsaném testu jsem použil nové fluorescenční barvivo DRAQ7, které již bylo úspěšně aplikováno pro hodnocení kvality spermií některých hospodářských zvířat. Toto barvivo je netoxickou alternativou ke konvenčně používanému jadernímu barvivu propidium iodidu. Barvení spermií pomocí DRAQ7 předcházelo cytometrické analýze vzorků trubčích spermií vystavených HOS testu. Hypoosmotický test již od 80. let 20 století je běžně používanou metodou určenou k posouzení funkcionální integrity plasmatické membrány spermií u savců. Avšak u včel tento velmi jednoduchý a rychlý test není stále rozšířen. Ukázalo se, že kombinace obou metodik (barvení jádra barvivem DRAQ7 a HOS test) představuje velice hodnotný nástroj pro rychlé a přesní cytometrické vyhodnocení kvality trubčího spermatu.

Abstract:

Assessment of semen quality (sperm viability) is an essential for the efficient honeybee semen storage. The motility of spermatozoa is not the ultimate parameter of sperm viability. Instead, the viability of spermatozoa is assessed by testing their structural or functional plasma membrane integrity. These assays are based primarily on the technique of microscopy evaluation of either fluorescent DNA dyes or hypo-osmotic "tail-coiling" reaction of spermatozoa. However, the technique of microscopy evaluation is time-consuming, subjective and often is not accurate. On the other hand, the technique of flow cytometry is rapid, objective and precise. Nowadays, this technique is affordable for many institutions, as the price of "benchtop" flow cytometer is relatively low. To best of our knowledge, there is currently no flow cytometry assay available for evaluation of functional integrity of honeybee spermatozoa. Here we report the establishing of novel flow cytometry assay for simultaneous evaluation of structural and functional plasma membrane integrity. DRAQ7, the new fluorescent DNA dye was used to test the structural integrity of plasma membranes. The hypo-osmotic "tail-coiling" reaction was used for flow cytometric assessment of functional integrity of spermatozoa plasma membranes. The combination of both is a valuable tool for rapid and precise evaluation of sperm viability in honey bees.

Keywords

životaschopnost, průtoková cytometrie, DRAQ7, trubčí spermie, HOS test, obrazová průtoková cytometrie, integrita plazmatické membrány

Keywords

drone sperm, viability, flow cytometry, DRAQ7, hypoosmotic shock, membrane integrity, imaging flow cytometry

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 11. 4. 2016

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Dalibor Titěra, CSc.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / field:
Animal Science / Animal Science