Epigenetické mechanizmy toxicity v in vitro modelu dýchací soustavy

Bc. Ondřej Brózman

Master's thesis

Epigenetic mechanisms of toxicity using in vitro model of respiratory system

Abstract:

Mezerové spoje jsou specializované uzavíratelné mezibuněčné kanálky, skrze které probíhá výměna informací a hmoty. Mezibuněčná komunikace mezerovými spoji (GJIC) je ústředním homeostatickým procesem, který je v buňce regulován četnými procesy. Hlavním regulačním mechanismem se zdá být fosforylace prostřednictvím kináz, jejichž působením může docházet jak k inhibici, tak nárůstu GJIC. Inhibice GJIC je pak chápána jako významný nádorově-promoční proces. Mnoho chemických agens aktivuje specifické protein-kinázy a zprostředkovaně tak ovlivňuje GJIC. Dle Světové zdravotní organizace (WHO) je v současné době znečištění ovzduší nejvážnějším zdraví ohrožujícím environmentálním faktorem, přičemž jednou z nejčastěji zmiňovaných skupin polutantů v této souvislosti jsou polycyklické aromatické uhlovodíky (PAHs). Zástupci nízkomolekulárních PAHs vykazují schopnost aktivace kaskády mitogenem aktivovaných protein-kináz (MAPK) následované inhibicí GJIC. S ohledem na všudypřítomnost těchto látek a možnou inhalační expozici se však zatím žádná studie nezabývala ovlivněním GJIC v buňkách lidské dýchací soustavy. Za účelem zjištění tohoto vlivu byly zvoleny dvě in vitro buněčné linie - testovací lidské bronchiální epiteliální buňky HBE1 a kontrolní krysí jaterní epiteliální buňky WB-F344. HBE1 jsou v této oblasti výzkumu zcela novým a nezavedeným testovacím systémem, proto bylo nutné před testováním PAHs zoptimalizovat experimentální postup. Následně byl metodou scrape-load dye transfer (SLDT) u obou linií zjištěn vliv na GJIC po expozici vybraným zástupcům PAHs – anthracen (ANT), 1-methylanthracen (1MeA), 2-methylanthracen (2MeA), 9-methylanthracen (9MeA), fluoren (FL), fluoranthen (FLTH), pyren (PYR), benzo[a]pyren (B[a]P) a chrysen (CHR). Bylo zjištěno, že v závislosti na struktuře molekuly jsou někteří zástupci PAHs (1MeA, 9MeA, FL, FLTH, PYR) schopni inhibovat GJIC v WB-F344 i HBE1, přičemž jiní GJIC významně neovlivňují (ANT, 2MeA, CHR). U B[a]P se tuto schopnost kvůli špatné rozpustnosti látky v expozičním médiu nepodařilo zjistit. U HBE1 nebylo možné dosáhnout inhibice GJIC vyšší než ~ 52 % oproti kontrole, což naznačuje možný rozdílný mechanismus účinku PAHs v in vitro modelech savčí dýchací soustavy. Výsledky také ukázaly, že část toxických účinků atmosférických PAHs by mohla být způsobena ovlivněním GJIC v exponovaných buňkách dýchací soustavy.

Abstract:

Gap junctions are specialized closable intercellular channels, through which exchange of information and matter is carried out. GJIC is the central homeostatic process, which is regulated in cells in a complex way. The main regulation mechanism seems to be mediated by phosphorylation through kinases, which are capable to up- or downregulate GJIC. Inhibition of GJIC is understood as major tumour-promoting process. Many chemical agents are potent activators of various protein-kinases and thus can indirectly inhibit GJIC. According to World health organization (WHO), air pollution is the most important environmental factor causing adverse health effects nowadays. One of the most frequently mentioned groups of pollutants in this context are polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs). Representatives of low molecular weight PAHs exhibit the ability to activate cascade of mitogen activated protein-kinases (MAPK) followed by inhibition of GJIC. Given the ubiquity of these substances and possible inhalation exposure, no study has dealt with influence of PAHs on GJIC in human lung tissue yet. In order to determine this influence, two in vitro cell lines were chosen – human bronchial epithelial cells HBE1 as the testing system and rat liver epithelial cells WB-F344 as the control system. HBE1 cells are completely new and unknown system in the issue of GJIC, thus it was essential to optimize the experimental procedures before the testing of PAHs. Both cell lines underwent scrape-load dye transfer method (SLDT) for determination of GJIC after exposure to PAHs - anthracene (ANT), 1-methylanthracene (1MeA), 2-methylanthracene (2MeA), 9-methylanthracene (9MeA), fluorene (FL), fluoranthene (FLTH), pyrene (PYR), benzo[a]pyrene (B[a]P) and chrysene (CHR). Based on the results it was found that depending on the structure of molecule, some PAHs (1MeA, 9MeA, FL, FLTH, PYR) are able to inhibit GJIC in WB-F344 and HBE1, but others are not (ANT, 2MeA, CHR). The potency of B[a]P to affect GJIC could not be determined due to its poor solubility in exposure medium. Testing results have also shown that it was not possible to achieve inhibition of GJIC greater than ~ 52% in comparison with control in HBE1 cells, indicating a possible different mechanism of action of PAHs using in vitro models of mammalian respiratory system. These results indicate that part of adverse health effects of atmospheric PAHs could be mediated by the inhibition of GJIC in exposed tissues.

Keywords

mezerové spoje, mezibuněčná komunikace mezerovými spoji, GJIC, nádorově-promoční proces, rakovina, polycyklické aromatické uhlovodíky, PAHs, TPA, HBE1, WB-F344, anthracen, ANT, 1-methylanthracen, 1MeA, 2-methylanthracen, 2MeA, 9-methylanthracen, 9MeA, fluoren, FL, pyren, PYR, fluoranthen, FLTH, benzo[a]pyren, B[a]P, chrysen, CHR, SLDT, luciferová žluť, gap junctions, gap junction intercellular communication, tumor promotion, cancer, polycyclic aromatic hydrocarbons, anthracene, 1-methylanthracene, 2-methylanthracene, 9-methylanthracene, fluorene, pyrene, fluoranthene, benzo[a]pyrene, chrysene, lucifer yellow

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2015

Thesis defence

• Date of defence: 3. 6. 2015
• Supervisor: Mgr. Jiří Novák, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Experimental Biology / Special Biology