Úloha regulačních proteinů v motilitě rybích spermií

MSc. Viktoriya DZYUBA, Ph.D.

Doctoral thesis

Role of regulatory proteins in fish sperm motility

Abstract:

Stanovení energetických aspektů motility spermií (Kapitola 2) bylo provedeno za použití demembranovaných spermií taxonomicky vzdálených druhů - kapra obecného a jesetera malého. Zvláštní pozornost byla věnována funkci ATP regeneračního systému: adenylát kináze (AK) a kreatin kináze (KK). Podařilo se nám poprvé prokázat, že ve spermatu jesetera malého je přítomen fosfokreatin/KK systém a hraje nezastupitelnou roli v regeneraci ATP. Spermie kapra i jesetera malého obsahuje obdobné systémy pro regeneraci ATP, přičemž účinnost těchto systémů se u daných druhů liší. Extrakty ze spermií jesetera malého vykazovaly ve srovnání s extrakty ze spermií kapra signifikantně vyšší hodnoty aktivity KK a ATPazy, a naopak nižší míru aktivity AK. Nízká bazální aktivita KK u kapra a AK u jesetera malého by mohla být zdrojem nejvýraznějšího efektu inhibice energetických zdrojů pro pohyby bičíku spermie u příslušného druhu. V naší laboratoři byla recentně prokázána existence procesu dozrávání spermií během post-testikulárního transportu spermatu u jesetera (Kapitola 3). To vedlo ke zkoumání různých faktorů regulujících tento proces, které zahrnují např. regulátory proteolýzy či prooxidační-antioxidační systém. V naší studii (Kapitola 3.3) jsme nezjistili žádné signifikantní rozdíly mezi proteolytickými profily seminální plazmy (SP) testikulárního spermatu (TS) a spermatu z Wolfových vývodů (SWV). To by mohlo naznačovat, že většina proteáz přítomných v SP dozrálého spermatu pochází z varlat. Stanovení amidázové a anti-proteolytické aktivity v SP ukázalo, že prokazatelné snížení sledovaných aktivit se odehrává během transportu spermií přes ledviny a Wolfovy vývody. Na základě našich pozorování, že inhibiční aktivita trypsinu během in vitro dozrávání TS blokuje proces dozrávání (Kapitola 3.1) a na základě výsledků zymografie a stanovení amidázové a anti-proteolytické aktivity předpokládáme, že snížení anti-proteolytické aktivity okolní tekutiny spermií během post-testikulárního transportu by mohlo být potřebné pro jeho dozrání. Tato studie dokazuje, že dozrávání spermatu jesetera a rozdílný čas jeho uchování ve Wolfových vývodech (in vivo uchovávání) jsou doprovázeny signifikantními změnami v parametrech motility a redoxní rovnováhy SP (Kapitola 4.1). V nezralém TS byla zjištěna vysoká míra TBA-reaktivních látek (TBARL) a vysoká aktivita antioxidačních enzymů ve srovnání s SWV. Vysoká aktivita enzymatického antioxidačního systému (AOS) umožnila TS vyrovnat se se škodlivými účinky nadměrné produkce volných kyslíkových radikálů a zachovat tak schopnost motility po post-testikulárním transportu nebo po dozrávání in vitro. Zvýšení obsahu TBARL během in vivo uchování nebylo doprovázeno odpovídajícím zvýšením aktivity AOS. Předpokládáme, že zvýšená doba zadržování spermií ve Wolfových vývodech má za následek oxidativní poškození vyplývající z nedostatečné účinnosti AOS, a v konečném důsledku tak vede k poklesu v parametrech motility. Krátkodobé uchovávání spermatu jesetera malého in vitro vedlo k signifikantnímu poklesu motility a rychlosti pohybu spermií beze změn v aktivitě AOS (Kapitola 4.2). To znamená, že AOS spermatu jesetera malého je dostatečně efektivní v prevenci rozvoje oxidativního stresu během krátkodobého uchovávání. Krátkodobé vystavení spermatu lína hypotonickým podmínkám indukovalo oxidativní stres a ve výsledku vedlo k poklesu kvality spermií (Kapitola 4.3). Kombinované výsledky studie týkající se regulace prooxidačního-antioxidačního stavu (Kapitola 4) během dozrávání spermií, aktivace motility, in vivo a in vitro uchovávání mohou potvrdit dvojí roli reaktivních kyslíkových radikálů (regulační neb

Abstract:

o naopak poškozující v závislosti na míře jejich utváření či odstraňování) ve fyziologii rybích spermií.

Abstract:

The investigation of the energetic aspects of spermatozoon motility implementation (Chapter 2) was carried out using demembranated spermatozoa of taxonomically distant fish species (common carp and sterlet). Special attention was given to the functioning of ATP regeneration systems: adenylate kinase (AK), and creatine kinase (CK). It was shown for the first time that the phosphocreatine/CK system is present in sterlet spermatozoa and plays an essential role in ATP regeneration. Spermatozoa of carp and sterlet were shown to have similar systems for ATP regeneration, while the efficacy of the studied systems differs in these species. The low baseline activity of CK in carp and AK in sterlet suggest these to be the source of the most pronounced effects of their inhibition on energy supply for flagella movement in the respective species. The presence of a maturational process during the post-testicular transit of sperm in sturgeon was recently ascertained in our laboratory (Chapter 3). This discovery prompted investigation of the factors that regulate this process including the involvement of proteolysis regulators and prooxidant-antioxidant system. As a result of this study (Chapter 3.3), we found that there was no significant difference between proteolytic profiles of seminal fluids (SF) of testicular sperm (TS) and Wolffian duct sperm (WS). It suggests that the majority of proteases present in SF of mature sperm originate in the testis. Measure of amidase and anti-proteolytic activities in the SF of sterlet sperm showed significant decrease in activities as the sperm passed through the kidneys and Wolffian ducts. Considering our observation that trypsin inhibition during in vitro TS maturation blocked the maturation process (Chapter 3.1), and based on zymography, amidase and anti-proteolytic activity determination, we think that the decrease in anti-proteolytic activity of spermatozoa surroundings during their post-testicular transit could be needed to prepare them for maturation. The present study showed that maturation of sturgeon spermatozoa and different times of storage in Wolffian ducts (in vivo storage), are accompanied by significant alterations in motility parameters as well as in SF redox balance (Chapter 4.1). A high level of TBA-reactive substances (TBARS) and a high activity of antioxidant enzymes were found in immature TS compared to those in WS. The high activity of the enzymatic antioxidant system (AOS) allows TS to cope with the deleterious effects of excessive reactive oxygen species production and to retain the ability to become motile after post-testicular transit, or after in vitro maturation. The increase in TBARS content during in vivo storage was not accompanied by a corresponding increase in activity of AOS. We suggest that extended time in the Wolffian ducts resulted in sperm oxidative damage resulting from inadequate AOS efficacy and, finally, in decreases in motility parameters. Short-term hypothermic in vitro storage of sterlet sperm resulted in a significant decrease in motility and velocity without changes of AOS activity (Chapter 4.2). It means that AOS of sterlet sperm is effective enough to prevent the development of oxidative stress during short-term storage. Short period of tench sperm exposure to hypotonic conditions was shown to induce oxidative stress and, as a result, sperm quality decline (Chapter 4.3). The combined results of the study concerning the regulation of sperm prooxidant-antioxidant status (Chapter 4) during spermatozoa maturation, motility activation and sperm in vivo and in vitro storage may confirm a dual role of reactive oxygen species (regulatory or damaging depending from the levels of their formation and elimination) in fish sperm physiology.

Keywords

adenylát kináza, antioxidační enzymy, frekvence vlnění bičíku, dozrávání, jeseter malý, kapr obecný, kreatin kináza, regulátory proteolýzy, uchovávání spermií

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 9. 2015

Accessible from:: 3. 9. 2015

Thesis defence

UNIVERSITY OF SOUTH BOHEMIA IN ČESKÉ BUDĚJOVICE

Faculty of Fisheries and Protection of Waters

Doctoral programme / field:
Zootechnics / Fishery