Biosensors and AFM technique for the monitoring of cell behaviour

Mgr. Zdenka Fohlerová, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Jedna z prvotních myšlenek pro konstrukci buněčných senzorů vzešla z potřeby omezit testování toxických či farmaceutických látek na živých zvířatech. Kultivace buněk na senzoru vyžaduje adherentní typ buněčné linie a adheze buněk je často podporována modifikací senzoru látkami zlepšujícími adhezivnost buněk. Co se týká aplikace biosensorových technologií, studium buněk je nejčastěji spojeno se senzory pracujícími na principu chemických mikrovážek (QCM) a impedance. QCM je často doplněno měřením dodatečných parametrů jako např. disipační energie a rezistance. Tyto metody mohou s dostatečnou citlivostí a bez použití značkovacích prób monitorovat buněčné procesy jako adheze, proliferace, diferenciace, exocytóza nebo apoptóza. Všeobecně vzato, změny v buněčné adhezi, morfologii a mechanických vlastnostech mohou být citlivě zaznamenány a následně vyhodnoceny. Jelikož často je potřeba zviditelnit buňky na senzorech, které jsou obvykle netransparentní pro použití optické mikroskopie, je nutné použít fluorescenční próby. Skenovací techniky, jako je např. mikroskopie atomárních sil (AFM), představují kvalitativní zlepšení především v oblasti rozlišení, které dosahuje atomární úrovně. Taktéž skenování v kapalině se stalo přínosné zejména pro studium nativních buněk. Navzdory větší komplikovanosti měření v kapalině, topografické obrázky nejsou ovlivněné řadou artefaktů pocházejících nejčastěji z fixačních činidel. Pokročilé spektroskopické AFM techniky, zejména pak “force – distance“ měření, nacházejí uplatnění pro studium mechanických vlastností buněk nebo studium interakčních sil mezi dvěma afinitními ligandy, přičemž jeden z nich je imobilizován na hrotu kantilevru. Disertační práce je zaměřena na konstrukci buněčného biosenzoru vhodného pro testování proapoptických látek, detekci exocytózy a monitorování cytoskeletárních změn buněk. AFM technika byla jednak použita pro studium mechanických vlastností buněk stimulovaných nocodazolem a jednak pro měření force-distance křivek mezi RGD peptidem imobilizovaným na hrotu kantilevru a integrinovými receptory na povrchu buňky, s cílem odhadnout sílu interakce a počet vazebných interakcí. Na závěr, AFM bylo využito k vyhodnocení fixačních artefaktů u dehydratačních a konjugačních fixačních činidel.

Abstract:

Mammalian cell-based biosensor was introduced several decades ago as a sensor exploiting the sensitivity of cells as a recognition element to the wide range of chemical agents including toxins, pharmaceutical and environmental compounds. It follows that the adherent cells and stable attachment on the planar sensor surface are crucial requirements for the sensor construction. The right choice of the adhesion promoting coating must be pre-tested. The cellular response to added compounds and other external effects might be detected using different transducers depending on the processes and parameters of interest. The most common transducers connected with adherent cells include quartz crystal microbalance (QCM) variously combined with the energy dissipation or the resistance measurements and impedance devices. Both provide very sensitive, real-time, label free and detailed information relating to cellular adhesion, proliferation, differentiation, exocytosis and apoptosis since the adhesiveness, spreading, morphology and viscoelasticity of the cells are changed. Scanning probe techniques as atomic force microscopy (AFM) are successively applied in recent time because of the resolution improvement to the atomic level. The unique advantage of scanning the sample in liquid gives us the opportunity to observe the structure of the native cells in detail. Despite some complications, the topography of the cell is not affected by artifacts originating from fixation procedures. The advanced technique of AFM as the measurement of force – distance curves allows to get more information either about molecular interaction in real time at the single molecular level or mechanical properties of the cells. When the tip becomes functionalized with a ligand recognizing e.g. the receptor on the cellular surface, then the distribution map of the receptor binding sites can be obtained or the interactive force can be estimated. The mechanical properties as elasticity or viscoelasticity of cells give an important information about the cytoskeletal rearragement of individual cells under either physiological or stimulated conditions. The aim of the thesis is to introduce the construction of cell-based biosensor and its applicability in drug-induced apoptosis, the antigen-stimulated exocytosis and drug-induced cytoskeletal changes. Finaly, AFM technique was applied for the study of mechanical properties in drug – treated cells and the force-distance curves were recorded between RGD peptide-coated tip and integrin receptors on the cell membrane whereupon the force and number of bonds could be estimated. The AFM was also used for the investigation of various fixatives and artefacts linked with themself.

Keywords

quartz crystal microbalance, impedance, atomic force microscopy, fluorescence, adhesion, apoptosis, exocytosis, cytoskeleton

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 25. 9. 2012

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 30. 10. 2012
• Vedoucí: doc. RNDr. Petr Skládal, CSc.
• Oponent: prof. Dr. Tibor Hianik, D.Sc., RNDr. Miroslav Machala, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie (čtyřleté) / Biochemie