Genomové nestability indukované absencí telomerázy u Arabidopsis

Bc. Petra Bulánková

Diplomová práce

Anotace:

Témou predkladanej práce bola cytogenetická charakterizácia dvoch telomerázovo-deficientných (línie A a B) a jednej kontrolnej kalusovej in vitro kultúry A. thaliana. Všetky kultúry dlhodobo prežívali, preto bolo otázkou, akým mechanizmom bola u telomerázovo-deficientných kultúr vyriešená ochrana koncov chromozómov. Základné pozorovania na cytogenetickej úrovni ale odhalili v prípade oboch telomerázovo-deficientných in vitro kultúr vysokú frekvenciu anafázových mostíkov (45% v prípade A línie a 83% u B línie v porovnaní s 0,9% u kontrolnej kultúry). Ani jedna z kultúr si teda nevytvorila alternatívnu stratégiu ochrany koncov chromozómov a v oboch neustále dochádza k prestavbám genómu. Pri pozorovaní však boli zaznamenané rozdiely medzi líniami vo veľkosti a morfológii jadier. Na popísanie týchto rozdielov bola použitá podrobná cytogenetická analýza s využitím merania veľkosti genómu a viacfarebnej fluorescenčnej in situ hybridizácie s centromérovými a 25S rDNA sondami. Analyzované boli všetky tri línie ako aj rastliny štandartného typu a ôsmej generácie telomerázovo-deficientných rastlín. Okrem toho bola použitá fluorescenčná in situ hybridizácia s jedinečnými sekvenciami a telomérovou sondou. U B línie bola pozorovaná vysoká variabilita vo všetkých sledovaných parametroch. U mnohých buniek dochádzalo k výraznej polyploidizácii a obrovskej amplifikácii 25S rDNA lokusov. V prípade jedinečných sekvencíi nebola amplifikácia pozorovaná. Naproti tomu bola A línia omnoho homogénnejšia a stabilizovanejšia vo všetkých meraných karyologických parametroch. Nárast polyploidie u štandartnej kultúry bol minimálny v porovnaní so štandartnými rastlinami a u telomerázovo-deficientných rastlín nebola zaznamenaná výraznejšia amplifikácia centromérových a 25S rDNA sekvencíi. Obrovské zmeny a prestavby v bunkách B línie teda neboli spôsobené in vitro kultiváciou samotnou, ale neustálou proliferáciou bez funkčných telomér. V oboch telomerázovo-deficientných líniách boli telomérové signály náhodne rozmiestnené a nenachádzali sa na koncoch chromozómov. Aj keď obe telomerázovo-deficientné in vitro kultúry proliferujú napriek genómovej nestabilite, karyologicky sa však výrazne odlišujú. Zatiaľ čo B línia je vysoko variabilná v dôsledku neustálych prestavieb genómu, u A línie došlo k čiastočnej stabilizácii pravdepodobne vďaka čiastočnej ochrane koncov chromozómov. Tieto pozorovania poukazujú na značnú schopnosť rastlín tolerovať genómovú nestabilitu.

Abstract:

The aim of presented work was the cytogenetic characterization of two independent A. thaliana telomerase-deficient (A and B) and control cell cultures. All cultures survived for longtime; therefore the question appeared how the end protection in telomerase deficient cell cultures was gained. Nevertheless basic cytogenetic observations revealed high frequency of anaphase bridges in both cases of telomerase-deficient in vitro cultures (45% in A line and 83% in B line compared to 0,9% in control culture). Thus, none of the telomerase-deficient cultures has adapted a mechanism to protect chromosome ends and both suffer from genome rearrangements. However, strong differences between A and B lines in nuclei size and morphology were noted. To access these differences, a detailed cytogenetic analysis was employed with the use of measurement of genome size and multicolor fluorescence in situ hybridization with centromeric and 25S rDNA probes. All three lines were analyzed as well as wild-type plants and plants from eighth generation of telomerase-deficient mutants. In addition, fluorescent in situ hybridization with unique sequences and telomere probe was used. In B line high variability in all measured parameters was observed. A number of cells displayed extensive polyploidization and huge multiplication of 25S rDNA loci. Amplification of unique sequences was not observed. On the other hand A line was much more homogeneous and stabilized in all measured karyological parameters. The increase of polyploidy in wild type calli was minimal compared to wild type plants and amplification of centromeric and 25S rDNA sequences was not observed in telomerase-deficient plants. Therefore, huge changes and rearrangements in B line cells are not due to in vitro cultivation per se but are a consequence of continuous proliferation without functional telomeres. Telomeric signals were randomly distributed and not anymore present at the ends of chromosomes in both telomerase deficient lines. Although both telomerase deficient in vitro cultures proliferate despite of genome instability, their karyology is very different. While B line is highly variable as a consequence of permanent genome rearrangements, in A line we expect partial stabilization probably due to limited protection of chromosome ends. These observations demonstrate the considerable ability of plants to tolerate genome instability

Klíčová slova

Arabidopsis thaliana, teloméry, telomerázová deficiencia, genómová nestabilita, prestavby genómu, telomeres, telomerase deficiency, genome instability, genome rearrangements

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 23. 5. 2006

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 13. 6. 2006
• Vedoucí: RNDr. Jiří Široký, CSc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Biologie / Molekulární biologie a genetika