Identifikace a kvantifikace genů zodpovědných za produkci biogenních aminů u vybraných bakterií

Bc. Veronika Málková

Master's thesis

Identification and Quantification of Genes Responsible for Production of Biogenic Amine by Selected Bacteria

Anotácia:

Předkládaná diplomová práce se zabývá zavedením a optimalizací metody Real time-PCR pro detekci a kvantifikaci genu adiA. Tento gen kóduje arginindekarboxylasu, enzym, který je zapojen v metabolické dráze produkce putrescinu u gramnegativních bakterií. Putrescin je jeden z biogenních aminů; je to látka v potravinách nežádoucí, protože její výskyt je spojován s kažením potravin. V rámci diplomové práce byly speciálně pro Real time-PCR navrženy specifické sady primerů, které slouží k ohraničení úseku DNA (v genu adiA), který má být sledován a dále amplifikován. Bylo potvrzeno, že vybraná/použitá sada primerů je opravdu specifická a reakce probíhají s optimální účinností (90 110 %). V průběhu práce byla sledována genová exprese genu adiA, metodou relativní kvantifikace (dle Pfaffla), u Escherichia coli CCM 3954 v závislosti na časových podmínkách kultivace. Nejvyšší exprese (R= ~2000) genu adiA bylo dosaženo po 12 hodinách kultivace této bakterie v kultivačním médiu s přídavkem L-argininu. Toto zjištění potvrzuje fakt, že gen adiA je opravdu genem inducibilním.

Abstract:

The present thesis deals with an implementation and optimization of the Real time-PCR method for a detection and quantification of the adiA gene. This gene is able to encode an arginine decarboxylase enzyme, which is involved in the metabolic pathway of putrescine production in gramnegative bacteria. It is known that putrescine belongs to the group of biogenic amines, and it is an undesirable substance in food because its occurrence is often associated with deterioration of foodstuffs. In the experimental part of this thesis, specific sets of primers were designed specifically for the Real-time PCR. These sets of primers were used for a determination of a particular DNA section in the adiA gene that was further studied and amplified. It was found that the used sets of primers are truly specific with optimum reaction efficiency varied between 90 to 110 percent. Further, gene expression of the adiA gene has been monitored by using Relative Quantification method (Pfaffl) in Escherichia coli CCM 3954 during different time cultivation. The highest expression of the adiA gene in CCM 3954 (R = ~ 2000) was achieved after 12 hours of cultivation in growth medium supplemented with L-arginine. It may be concluded that this finding clearly confirms the inducibility of the adiA gene.

Kľúčové slová

putrescin, Real time-PCR, relativní exprese, adiA

Jazyk práce: Czech

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 16. 5. 2016

Zverejniť od: 16. 5. 2016

Obhajoba závěrečné práce

Tomas Bata University in Zlín

Faculty of Technology

Master programme / odbor:
Chemistry and Materials Technology / Environmental Protection Engineering