Digitální zobrazování nanočásticových značek pomocí IR laserové ablace spojené s SP ICP MS

Mgr. Marek Stiborek, Ph.D.

Disertační práce

Digital imaging of nanoparticle tags using IR laser ablation single-particle ICP MS

Anotace:

V této práci je prezentována nová technika digitálního mapování biomarkerů ve tkáních založená na desorpci a přesném počítání intaktních značek zlatých nanočástic (Au NP) za pomoci infračervené laserové ablace spojené se zobrazovací hmotnostní spektrometrií s indukčně vázaným plazmatem v režimu detekce jednotlivých částic (IR LA SP ICP MS). Transportní účinnost Au NP optimalizovaného IR ablačního systému včetně ablační cely dosahuje 83 %. Ve srovnání s konvenční ultrafialovou (UV) LA dochází během procesu laserové ablace k minimálnímu rozpadu zlatých nanočástic díky jejich nízké absorpci při vlnové délce 2 940 nm. Tento přístup k detekci NP je demonstrován na zobrazování proliferačního markeru jaderného proteinu Ki-67 ve 3D buněčných agregátech (sféroidech) buněčných linií kolorektálního karcinomu HT29 a HCT116 pomocí dvoustupňové metody barvení s biotinylovanou monoklonální protilátkou anti-Ki-67 a konjugátu streptavidinu s Au NP. Výsledky jsou porovnávány s běžnými technikami, jakými jsou konfokální fluorescenční mikroskopie (CFM) a UV LA ICP MSI. Protein Ki-67 byl vybrán díky jeho charakteristickému rozložení ve sféroidu, kde jeho nejvyšší koncentrace je ve vnější proliferační zóně sféroidu a rychle klesá směrem k nekrotickému jádru. Přesné počítání 20nm Au NP s detekčním limitem jedné částice na pixel umožňuje vytvářet ostré digitální mapy distribuce specifických biomarkerů ve tkáni. Kromě toho je v důsledku nepřítomnosti specií absorbujících IR záření silně potlačena desorpce nespecificky vázaných NP značek z oblasti (sklo) mimo sféroid.

Abstract:

This work presents a novel technique for the digital mapping of biomarkers in tissues based on desorption, and precise counting of intact gold nanoparticle (Au NP) tags using IR laser ablation single-particle inductively coupled plasma mass spectrometry imaging (IR LA SP ICP MS). The transport efficiency of Au NPs of the optimised IR ablation system, including the ablation cell, reached 83%. Compared to conventional UV laser ablation, there is minimised disintegration of Au NPs during the ablation process due to their low absorption at 2 940 nm. This approach to NP detection is demonstrated by imaging the proliferation marker, nuclear protein Ki-67, in 3D cell aggregates (spheroids) of colorectal cancer cell lines HT29 and HCT116 via two-stage staining method with biotinylated anti-Ki-67 monoclonal antibody and streptavidin-Au NP conjugate. The results are compared with common confocal fluorescence microscopy (CFM) and UV LA ICP MSI techniques. Ki-67 was chosen because of its characteristic distribution in the spheroid; its highest concentration is in the outer proliferative zone of the spheroid, and its concentration decreases rapidly towards the necrotic core. Precise counting of 20 nm Au NP tags with an SP detection limit per pixel enables the generation of sharp digital distribution maps of specific biomarkers in tissue. In addition, the desorption of non-specifically bound NP tags from regions (glass) outside the spheroid is strongly suppressed due to the absence of species absorbing the IR radiation.

Keywords

LA ICP MS, zobrazovací hmotnostní spektrometrie, digitální zobrazování, IR laser, laserová ablace, režim jednotlivých nanočástic, zlaté nanočástice, hmotnostní značky, sféroid, Ki-67, HT29, HCT116

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 4. 1. 2023

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 8. 2. 2023
• Vedoucí: prof. Mgr. Jan Preisler, Ph.D.
• Oponent: Mgr. Jan Křivánek, Ph.D., prof. Ing. Oto Mestek, CSc., doc. Ing. David Milde, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Chemie / Analytická chemie