NMR study of the delta subunit of RNA polymerase from gram-positive bacteria

Mgr. Veronika Papoušková, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Hlavním cílem této dizertační práce je strukturní charakterizace dvou proteinových domén delta podjednotky RNA polymerasy z gram-pozitivních bakterií pomocí metody NMR. 3D struktura N-koncové domény delta proteinu byla definována s využitím standardních postupů, doplněných o netradiční metody pro určování malých zbytkových interakcí. Pro tento účel bylo připraveno několik vzorků v oritentovaných médiích a získaná data byla před užitím ve výpočtech pečlivě testována. Chování nestrukturované C-koncové části proteinu bylo popsáno pomocí tří nezávislých metod: sledování odchylky přiřazených chemických posunů od hodnot typických pro náhodné klubko, analýzy změn v relaxačním chování proteinu po zavedení spinových značek a studia rychlé dynamiky. Téma a hlavní motivace této dizertační práce jsou stručně předsta- veny v kapitole 1. Kapitola 2 je věnována biologickému úvodu do problematiky strukturní studie RNA polymerasy z gram-pozitivních bakterií a představuje předběžné výsledky našich kolegů z pražské laboratoře Libora Krásného, se zaměřením na in vitro a in vivo experimenty zkoumající funkci delta podjednotky. Součástí teoretického úvodu je také přehled NMR metod běžně užívaných pro určování proteinové struktury i netradičních metod pro charakterizaci (částečně) neuspořádaných proteinů. V kapitole 3 jsou představeny postupy nově zavedené v rámci této dizertační práce. Jedná se o protokoly pro přípravu anizotropních vzorků ve třech různých orientujících prostředích, včetně analýzy spekter a validace získaných dat. Dále je zde shrnuta strategie pro přiřazení frekvencí páteře a bočních řetězců neuspořádaných částí proteinů a diskutován protokol pro zavedení spinových značek do proteinového vzorku za účelem analýzy krátkodobých přechodných kontaktů na vzdálenost značně prevyšující tradičně měřená strukturní data. Kapitola 4 obsahuje samotné výsledky práce na delta proteinu s využitím metod zmíněných v předchozím textu. Velmi dobře určená struktura N-koncové části proteinu a obsáhlá studie C-koncové části proteinu odhalují chování celé delta podjednotky. Text práce je pomocí odkazů přímo provázán s přiloženými publikovanými či odeslanými články.

Abstract:

This Ph.D. thesis is focused on an NMR study of the delta subunit of RNA polymerase unique for gram-positive bacteria. The main purpose of this work was to structurally characterize both domains of the delta protein as accurately as possible. In the case of the ordered N-terminal domain, a conventional strategy, complemented with non-traditional methods utilizing small residual dipolar couplings, was exploited. Several partially oriented samples of the N-terminal delta protein were prepared and carefully validated orientational restraints were used in the structure calculation. Then, the unstructured C-terminal domain was described using three independent types of data: deviations of assigned chemical shifts from random coil values, paramagnetic relaxation enhancement introduced by spin labels, and NMR relaxation parameters of protein fast dynamics. The topic and motivation of the thesis are briefly introduced in Chapter 1. Chapter 2 presents the biological background of this study obtained from the literature, and preliminary in vitro and in vivo experiments done in the laboratory of Libor Krásný, where this project was initialized. Next, a general overview of NMR methods routinely used for the protein structure determination as well as novel tools for characterization of (partially) disordered proteins by NMR are summarized. Chapter \ref{ch_methods} describes new protocols developed and implemented in our laboratory within the frame of my Ph.D. study. First, the preparation of anisotropic samples in three various orienting environments followed by a determination and validation of orientational restraints is discussed. Second, the successfully applied strategy of frequency assignment of backbone and side-chain nuclei of disordered parts of proteins is summarized. And third, the protocol for spin labels attachment in order to analyze transient contacts beyond the range of distance restraints is described. Chapter 4 presents the application of the above mentioned NMR methods to both the N-terminal construct and the full-length delta protein. A high-quality structure of the N-terminal domain and a comprehensive study of the C-terminal tail of the delta subunit are discussed with reference to the published or submitted articles enclosed as Papers 1-4.

Keywords

delta subunit, RNA polymerase, NMR, assignment, structure, disordered proteins

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 3. 9. 2012

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 10. 10. 2012
• Vedoucí: prof. Mgr. Lukáš Žídek, Ph.D.
• Oponent: doc. Ing. Richard Hrabal, CSc., prof. András Perczel, D.Sc.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Biochemie (čtyřleté) / Biomolekulární chemie