Funkční ověření stabilizačních domén pro produkci antimikrobiálních peptidů v rostlinách

Mgr. David KOPEČNÝ

Master's thesis

Functional verification of stabilization tags for expression of antimicrobial peptides in planta

Abstract:

Rostoucí rezistence bakteriálních patogenů vyžaduje hledání nových látek, které neindukují bakteriální rezistenci. Antimikrobiální peptidy jsou obvykle kladně nabité krátké peptidy, které mohou interagovat s bakteriálními membránami a jsou schopné zabíjet bakterie odlišným mechanismem než antibiotika. Proto představují zajímavou alternativu ke klasickým antibiotikům a mimořádně dobře fungují proti širokému spektru bakterií. Jejich produkce však naráží na řadu překážek, a to především kvůli vysokým nákladům na jejich produkci a času potřebným pro jejich přípravu. Tato práce se zaměřuje na produkci antimikrobiálního peptidu katelicidinu v různých expresních systémech. Pro tento účel byly ke katalicidinu fúzovány různé proteinové značky, jako například DAMP4 spolu s několika místy pro štěpení, aby byla umožněna účinná a nízko nákladová purifikace. Rekombinantní protein s DAMP4 byl exprimován pod T7 promotorem v Escherichia coli v mikrobiálním fermentoru, za účelem optimalizace purifikace a štěpení. Bakteriální proteiny byly precipitovány termální denaturací a fúzní protein odštěpen. Antimikrobiální peptid byl dále analyzován a purifikován pomocí semipreparativní HPLC-MS. Nakonec byla antimikrobiální aktivita katelicidinu potvrzena testováním minimální inhibiční koncentrace. Rekombinantní proteiny s jinými značkami byly testovány v Nicotiana benthamiana transientní expresí. Některé další značky byly také vybrány pro stabilní expresi v Arabidopsis thaliana pod promotorem 35S. Práce přináší nové poznatky pro vývoj produkčního systému antibakteriálních peptidů.

Abstract:

Growing resistance of bacterial pathogens urges the search for new antimicrobial substances that do not induce bacterial resistance. Antimicrobial peptides are usually positively charged short peptides that can interact with bacterial membranes and are able to kill bacteria by a different mechanism than antibiotics. Therefore, they create an interesting alternative to classical antibiotic and perform extremely well against broad spectrum of bacteria. Unfortunately, their production presents a major obstacle because of high cost and time consumed for their preparation. This thesis focusses on production of human antimicrobial peptide cathelicidin in different expression systems. For this purpose, various protein tag such as DAMP4 was fused to antimicrobial peptide cathelicidin with several different cleavage sites to allow efficient as well as low-cost purification. Recombinant protein fused to DAMP4 was expressed under T7 promoter in Escherichia coli in the microbial fermentor vessel to optimize both purification and cleavage. Bacterial proteins were precipitated by thermal denaturation, protein tag was cleaved off and antimicrobial peptide further analysed and purified by semi preparative HPLC-MS. Finally, antimicrobial activity of cathelicidin was confirmed by testing minimum inhibitory concentration. Recombinant proteins with other tags were tested in Nicotiana benthamiana by transient expression. Also, some tags were chosen for stable expression in Arabidopsis thaliana under 35S promotor. The results bring new knowledge for developing a production system for antimicrobial peptides.

Keywords

antimikrobiální peptid, rekombinantní produkce, afinitní purifikace, LC-MS, antimikrobiální aktivita

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 3. 5. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 15. 6. 2020
• Supervisor: prof. RNDr. Ivo Frébort, CSc., Ph.D.

Palacký University Olomouc

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Biochemistry