Identifikace tumor-specifických mutovaných forem K-ras proteinu pomocí hmotnostní spektrometrie

Bc. Jakub PŘICHYSTAL

Master's thesis

Identification of tumor-specific mutated forms of K-ras protein using mass spectrometry

Abstract:

K-ras protein je známým markerem rakovinových onemocnění, jelikož je nacházen u mnoha typů nádorů v mutované formě. Znalost typu mutace má význam pro cílenou léčbu, ale mohla by sloužit i jako prediktor prognózy pacienta. Existují metody pro zjištění mutace na genové úrovni. Přítomnost genu ale nemusí znamenat skutečnou přítomnost proteinu v buňce. Jedinou cestou pro zjištění přítomnosti proteinu v buňkách je proteomika. Součástí práce je literární rešerše, která se zabývá vlastnostmi K-ras proteinu a jeho funkcí v buňce spolu s cílenou léčbou jak na samotný protein, tak jeho downstreamové cíle. Současně představuje proteomiku jako samostatný vědní obor a hmotnostní spektrometrii jako její hlavní nástroj. V rámci praktické části byly navrženy čtyři přístupy pro zpracování proteinových vzorků za účelem identifikace mutací na K-ras proteinu pomocí LC-MS analýzy. Použité přístupy zahrnovaly využití SDS-PAGE, imunoprecipitace proteinů na magnetických kuličkách s imobilizovaným proteinem A nebo proteinem G a metodu FASPxFAST, zahrnující filtraci přes membránové filtry. Na základě prvotních výsledků analýzy lyzátů buněčné linie CCRF-CEM, byl následně zvolen optimální přístup pro identifikaci mutace na K-ras proteinu u jiných buněčných linií. Imunoprecipitace na magnetických kuličkách s imobilizovaným proteinem A byla použita pro analýzu média, v kterém byly inkubována buněčná linie CCRF-CEM. Pouze dva přístupy se v navržené metodice ukázaly jako aplikovatelné SDS-PAGE a imunoprecipitace na magnetických kuličkách s proteinem A. Návrhy pro další vylepšení jednotlivých metod jsou zahrnuty v diskuzi.

Abstract:

K-ras protein is a well-known tumor-specific marker. Its mutated form is commonly found in many human cancers. Knowledge of the mutation type is important for the targeted therapy or it can be used as a prognosis predictor in patients. Genetic methods for determination of the K-ras mutations have been developed. The presence of the mutated gene does not always mean the presence of the protein in the cells. To confirmation of the presence of the protein can be done only by proteomics. The properties of the K-ras protein and its function in the cell are presented in the Thesis. Terapies targeted against K-ras or its downstream targets are described as well. Concurrently, the proteomics is presented as an individual discipline with the mass spectrometry as its major tool. In Diploma Thesis were designed four approaches for a protein sample processing method in order to identify the mutations of K-ras protein by LC-MS analysis. The designed approaches were comprised of the SDS-PAGE, the immunoprecipitation on the magnetic beads with immobilized protein A or protein G and the FASPxFAST method with the filtration through the membrane filters. Based on the results obtained by the analysis of the cell lysate of the CCRF-CEM cell line, the optimal approach for the identification of the K-ras protein mutation was selected for the analysis of other cell lines. The immunoprecipitation on the magnetic beads with immobilized protein A was used for the analysis of the cell medium in which the CCRF-CEM cells were incubated. Only two approaches were proven to be applicable - the SDS-PAGE and the immunoprecipitation on the magnetic beads with immobilized protein A. The suggestions for the next improvements for all protein sample processing methods are included in the discussion.

Keywords

K-ras protein, proteomika, hmotnostní spektrometrie

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 24. 4. 2015

Accessible from:: 24. 4. 2015

Thesis defence

• Supervisor: MUDr. Petr Džubák, Ph.D.

PALACKÝ UNIVERSITY IN OLOMOUC

Faculty of Science

Master programme / field:
Chemistry / Analytical Chemistry