Charakteristika gonozómů technikami qRT-PCR a ddPCR u klisny se symptomy syndromu androgenní insenzitivity – kauzální studie

Bc. Pavlína Čadová

Master's thesis

Characterization of gonosomes by qRT-PCR and ddPCR techniques in a mare with symptoms of androgen insensitivity syndrome - a causal study

Abstract:

Syndrom androgenní insenzitivity (AIS) patří u koní mezi jednu z nejčastějších poruch sexuálního vývoje. Jedinec trpící tímto syndromem má běžný karyotyp hřebce s gonozómy XY, ale fenotypový projev je samičí. Tento patologický stav se projevuje jako následek nedostatečného působení androgenů během ontogenetického vývoje samce z důvodu mutace v genu pro androgenní receptor. V koňském genomu bylo zatím popsáno pouze 5 mutací, které jsou kauzální pro vznik tohoto syndromu. Jedinec Nikita, jež je hlavním subjektem této diplomové práce, vykazoval symptomy syndromu androgenní insenzitivity, zahrnující samičí fenotyp, projevy samčího chování a ambivalentní pohlavní orgány. Pro molekulární analýzy byla izolována DNA z chlupových cibulek pomocí kitu NucleoSpin Tissue XS (Macherey-Nagel, Německo).V prvním kroku byla provedena genotypizace jedince Nikity i kontrolních vzorků pomocí metody PCR. Byly navrženy specifické primery pro markery HOR4 (gen SRY) a HOR10 (gen pro amelogenin – AMEL). Pomocí amplifikace těchto markerů bylo zjištěno, že jedinec trpící symptomy syndromu androgenní insenzitivity má přítomny pouze chromozomy X a nemá gen SRY a jedná se tedy o samici. Pro potvrzení výsledků byla optimalizována metoda relativní kvantifikace, při níž byla porovnávána míra amplifikace, daná počtem CNV (copy number variation), mezi geny CYLC1, SRY a autozomálním genem MCEE. Byly navrženy specifické primery pro markery HOR1 (gen CYLC1 na nehomologní části chromozomu X), HOR4 (gen SRY na chromozomu Y) a HOR7 (gen MCEE na chromozomu 1), který byl využit jako referenční gen. Získané výsledky potvrdily, že je možné využít tyto markery pro rozlišení pohlaví u koní. Hodnota CNV u genu CYLC1 dosahovala u samic přibližně 1,00, jelikož mají chromozom X ve dvou kopiích, u samců byla hodnota přibližně poloviční. Při porovnání míry amplifikace genu CYLC1 a SRY u samců byla hodnota přibližně stejná, což dokazuje přítomnost obou typů pohlavních chromozomů po jedné kopii. U jedince se symptomy AIS byly detekovány dvě kopie chromozomu X a bylo tak potvrzeno samičí pohlaví. Metoda digitální dropletové PCR byla využita pro absolutní kvantifikaci molekul DNA ve vzorcích a určení přesné hodnoty CNV. Absolutní kvantifikace potvrdila u jedince Nikity samičí pohlaví, hodnota CNV u jejího vzorku byla 0,9175, což odpovídá hodnotě pro běžnou klisnu. Pro ověření přítomnosti kauzální mutace na první pozici start kodonu (c.1A>G ) byla u jedince Nikity sekvenována část genu pro androgenní receptor. Kauzální mutace nebyla prokázána, byla však nalezena bodová mutace na pozici c.322, při níž došlo k substituci alely C za alelu T. Tato substituce, vedoucí ke vzniku cysteinu místo původně vznikajícího argininu, však podle dostupné literatury není kauzální pro vznik syndromu androgenní insenzitivity. Přestože v diplomové práci nebyla odhalena příčina samčích projevů chování u klisny Nikity ani nebyla prokázána kauzální mutace vedoucí ke vzniku syndromu androgenní insenzitivity, lze metody navržené v této práci využít k determinaci pohlaví u koní v dalších výzkumech.

Abstract:

Androgen insensitivity syndrome (AIS) is one of the most common disorders of sexual development in horses. An individual with androgen insensitivity syndrome has the normal karyotype of a stallion with XY gonosomes, but the phenotypic expression is female. This pathological condition manifests as a consequence of insufficient androgen exposure during ontogenetic development of the male due to a mutation in the androgen receptor gene. So far only 5 mutations have been described in the equine genome that are causative of this syndrome. The individual called Nikita, who is the main subject of this thesis, exhibited symptoms of androgen insensitivity syndrome, including a female phenotype, typical male behaviour and ambivalent genitalia. For molecular analyses, DNA was isolated from the hair bulbs of a total of 24 horses using the NucleoSpin Tissue XS kit (Macherey-Nagel, Germany). In a first step, genotyping of Nikita and control samples was performed using PCR. Specific primers for markers HOR4 (SRY gene) and HOR10 (AMEL gene) were designed. Using amplification of these markers, it was found that the individual suffering from symptoms of androgen insensitivity syndrome were present only X chromosomes and lacks the SRY gene and is therefore a female. To confirm the results, a relative quantification method was optimized by comparing the amplification rate, given by copy number variation (CNV), between CYLC1 gene, SRY gene and autosomal MCEE gene. Specific primers were designed for the markers HOR1 (CYLC1 gene on the non-homologous part of the X chromosome), HOR4 (SRY gene on the Y chromosome) and HOR7 (MCEE gene on chromosome 1), which was used as a reference gene. The results obtained from this experiment confirmed that it is possible to use these markers for sex determination in horses. The CNV value for the CYLC1 gene was approximately 1.00 in females, since they have two copies of the X chromosome, whereas in males the value was approximately half that in females. When comparing the amplification rate of the CYLC1 and SRY gene in males, the value was approximately the same (0.50), demonstrating the presence of both types of sex chromosomes with one copy each. In the individual with AIS symptoms, two copies of the X chromosome were detected, confirming the female sex. The digital droplet PCR method was used for absolute quantification of DNA molecules in the samples and determination of the exact copy number variation value. Absolute quantification confirmed the female sex of Nikita, the CNV value for her sample was 0.9175, which corresponds to the value for a normal mare. To verify the presence of a causal mutation at the first position of the start codon (c.1A>G), the part of the androgen receptor gene was sequenced. The causative mutation was not found, but a single nucleotide polymorphism at position c.322 was found, in which the C allele was substituted for the T allele. However, this substitution, leading to the formation of cysteine instead of the originally formed arginine, is not causal for the development of androgen insensitivity syndrome according to the available literature. Although the thesis did not reveal the cause of the male behavioural manifestations in the mare Nikita, nor was a causal mutation shown to lead to androgen insensitivity syndrome, the methods proposed in this thesis can be used to determine sex in horses in future research.

Keywords

Equus caballus, gonozómy, qRT-PCR, ddPCR, syndrom androgenní insenzitivity

Keywords

androgen insensitivity syndrome, Equus caballus, gonosomes, qRT-PCR, ddPCR

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 9. 4. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 15. 5. 2023
• Supervisor: Ing. Vladimíra Sedláková, Ph.D.
• Reader: Tereza Krejčová, Mgr. Ing.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Master programme / specializace:
Biotechnology / Reproduction Biotechnology