Nové možnosti analýzy sekvenčně- a strukturně specifické analýzy DNA a RNA a jejich chemické modifikace pomocí elektrochemických metod

Ing. Ondrej Hesko, Ph.D.

Disertační práce

New possibilities of sequence- and structure-specific analysis of DNA and RNA and their chemical modification using electrochemical methods

Abstract:

This dissertation thesis summarizes the findings of nucleic acid electrochemistry and includes a summary of 1 published paper in an impacted journal and two un-published studies in progress. 1) This work presents a rapid detection technique for short oligoG RNAs present in large excess of mononucleotide (cGMP), which models conditions in reaction mixtures of non-enzymatic nucleotide polymerization. The method is based on the measurement of guanine oxidation signals provided by RNA oligomers adsorbed on the surface of a pyrolytic graphite electrode. To remove co-adsorbed cGMP selective desorption by used surfactants (SDS, Tween 20 and Triton X-100) or by washing the electrode in deionized water at elevated temperature has been proposed. 2) Another unpublished work deals with the study of hybridization of struc-tured DNA on boron-doped diamond electrodes with different sp2 carbon content. A comprehensive morphological and spectral characterization of the synthesized pla-nar diamond films was performed, followed by cyclic voltametric experiments with the redox probes [Ru(NH3)6]3+/2+ and [Fe(CN)6]3-/4- and impedance spectroscopy was used to characterize the electrode bilayer. Subsequently a DNA hybridization assay based on the measurement of the electroactive product generated by the en-zymatic reaction was applied, which was able to distinguish the formation of DNA secondary structures on the BDD surface and the effect of sp2 carbon content on this hybridization analysis is studied. 3) In next study, two electrochemical approaches were used to detect “citrus bark cracking viroid” (CBCVd). First, reverse transcription was performed, then cDNA was used as template for specific PCR. Detection of CBCVd was based on di-rect oxidation of the incorporated deazaguanine into the PCR product and of biotin-labeled cytosine during PCR. The second approach is indirect detection of the elec-trochemically active product of the enzymatic reaction, which is present in the assay only when biotin-containing DNA is present on the PGE.

Abstract:

Táto dizertačná práca zhrnuje poznatky elektrochémie nukleových kyselín a obsa-huje stručný obsah 1 publikovanej práce v impaktovanom časopise a dve zatiaľ ne-publikované rozpracované štúdie. 1) Práca prezentuje rýchlu detekčnú techniku krátkych oligoG RNA prítomných vo veľkom nadbytku mononukleotídu (cGMP), kto-rá modeluje podmienky v reakčných zmesiach neenzymatickej polymerizácie nukleo-tidov. Metóda je založená na meraní oxidačných signálov guanínu (G), ktoré posky-tujú oligoméry RNA adsorbované na povrchu elektródy z pyrolytického grafitu. Na odstránenie koadsorbovaného cGMP, bola navrhnutá jeho selektívna desorpcia po-mocou povrchovo aktívnych látok (SDS, Tween 20 a Triton X-100) alebo premytím elektródy v deionizovanej vode pri zvýšenej teplote. 2) Ďalšia ešte nepublikovaná práca sa zaoberá štúdia hybridizácie štruktúro-vanej DNA na bórom dopovaných diamantových elektródach (BDD) s rôznym obsa-hom sp2 uhlíka. Bola prevedená komplexná morfologická a spektrálna charakterizá-cia syntetizovaných planárnych diamantových filmov a následne boli využité cyklické voltampérometrické experimenty s redoxnými sondami [Ru(NH3)6]3+/2+ a [Fe(CN)6]3-/4- a na charakterizáciu elektródovej dvojvrstvy bola využitá impedančná spektroskopia. Následne bola aplikovaná hybridizačná analýza DNA založená na me-raní enzymatickou reakciou generovaného elektroaktívneho produktu, ktorá bola schopná rozlíšiť formovanie sekundárnych štruktúr DNA na povrchu BDD a je štu-dovaný vplyv obsahu sp2 uhlíka na túto hybridizáciu DNA. 3) Boli využité dva elektrochemické prístupy na detekciu viroidov, konkrétne „citrus bark cracking“ viroida CBCVd. Najskôr bola prevedená reverzná transkripcia sekvencie RNA, následne cDNA bola použitá ako templát pre špecifickú PCR. Detek-cia viroidov bola založená na priamej oxidácii inkorporovaného deazaguanínu do PCR produktu a inkorporácii cytozínu značeného biotinom rovnako behom PCR. Druhý prístup je nepriama detekcia elektrochemicky aktívneho produktu enzymatic-kej reakcie, ktorý je pri analýze prítomný len vtedy, keď je na elektróde prítomná DNA obsahujúca inkorporovaný biotin.

Klíčová slova

Elektrochémia, DNA, značenie DNA, elektrochemické biosenzory, elektróda z pyrolytického grafitu, elektróda z bórom dopovaného diamantu, Electrochemistry, DNA labelling, electrochemical biosensors, pyrolytic graphite electrode, boron doped diamond electrode

Jazyk práce: slovenština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 19. 7. 2024

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 3. 9. 2024
• Vedoucí: doc. RNDr. Miroslav Fojta, CSc.
• Oponent: doc. Ing. Renáta Šelešovská, Ph.D., doc. RNDr. Miroslav Gál, PhD

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Genomika a proteomika / Genomika a proteomika