Highly sensitive analysis of glycoproteins by new labels for capillary electrophoresis coupled with fluorescence detection and/or mass spectrometry

Ing. Denisa Smolková, Ph.D.

Disertační práce

Anotace:

Analýza glykanů, oligosacharidové části glykoproteinů, je stále náročná vzhledem k jejich strukturní složitosti danou jednotlivými monosacharidovými jednotkami, jejich kombinacemi, vazbami a izomerií a také technickým omezením používané analytické instrumentace, jako je účinnost elektrosprejové ionizace a citlivost detekce. Molekuly sacharidů vykazují nízkou ionizační účinností, nemají žádný náboj kromě některých obsahujících kyseliny sialové a neobsahují chromofory ani fluorofory pro absorpční nebo fluorescenční detekci. Navzdory desetiletím výzkumu a vývoje technik v oblasti derivatizace glykanů stále existuje potenciál pro zlepšení detekce prostřednictvím nových značek s lepšími vlastnostmi. Teoretická část této práce představuje glykoproteiny a jejich analýzy na různých úrovních, jako jsou glykoproteiny, glykopeptidy a uvolněné glykany. Pozornost je věnována především různým derivatizačním strategiím pro analýzu oligosacharidů a glykanů kapilární elektroforézou s detekcí pomocí laserem indukované fluorescence a/nebo hmotnostní spektrometrie. Praktický výzkum se zabývá návrhem, syntézou a aplikací řady derivatizačních činidel pro zlepšení parametrů, jako je účinnost značení, doba značení, kvantový výtěžek fluorescence a citlivost fluorescenční a hmotnostně-spektrometrické detekce. Značky se liší strukturou základní molekuly, typem derivatizační chemie a požadovanou modifikací, která umožňuje vyladění fluorescenčních a hmotnostně-spektrometrických vlastností. Pro dosažení co nejlepších výsledků byly všechny derivatizační a analytické podmínky optimalizovány s využitím standardů maltooligosacharidů a nové značky byly porovnány s komerčně dostupnými. Nakonec byly vyvinuté postupy značení použity pro analýzy N-vázaných glykanů kapilární elektroforézou spojenou s laserem indukovanou fluorescenční a/nebo hmotnostně spektrometrickou detekcí.

Abstract:

The analysis of glycans, oligosaccharide parts of glycoproteins, remains challenging due to their structural complexity, diverse glycan conjugation patterns, and technical limitations such as ionization efficiency and detection sensitivity. Saccharide molecules suffer from low ionization efficiency, have no charge except for those containing sialic acids, and do not contain chromophores or fluorophores for optical detection. Despite decades of research and development in glycan derivatization techniques, there remains potential for improvement through new labels with improved performance characteristics. The theoretical part of this work introduces glycoproteins and their analysis on different levels such as glycoproteins, glycopeptides, and released glycans. The main focus is on different oligosaccharide derivatization strategies and glycan analysis by capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence and/or mass spectrometry detection. The practical research deals with designing, synthesizing, and applying a series of derivatization reagents to improve parameters such as labeling efficiency, labeling time, fluorescence quantum yield, and detectability by mass spectrometry. The labels differ in core molecules, type of derivatization chemistry, and required modification, allowing tuning of fluorescence and MS properties. To achieve the best possible results, all derivatization and analytical conditions have been optimized using maltooligosaccharide standards, and novel labels were compared with the commercially available ones. Finally, the developed labeling procedures were applied for analyses of N-linked glycans by capillary electrophoresis coupled with laser-induced fluorescence and/or mass spectrometry detection.

Keywords

Labeling, Oligosaccharides, Glycans, Mass spectrometry, Capillary electrophoresis, Sample preparation

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 29. 4. 2025

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 25. 6. 2025
• Vedoucí: Mgr. Jana Lavická, Ph.D.
• Oponent: doc. Ing. Petr Česla, Ph.D., M.Sc. Gábor Járvás, Ph.D., doc. RNDr. Jan Petr, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Doktorský studijní program / obor:
Chemie / Analytická chemie