Studium komplexů mezi oligonukleotidy a některými alkaloidy

Mgr. Matúš Durec

Bachelor's thesis

Study of complexes between alkaloids and oligonucleotides

Abstract:

The aim of theoretical part of the bachelor thesis was to approach binding mode of small molecules to DNA with focus on noncovalent interactions. This kind of interactions inhibits replication and transcription of DNA, and ultimately causes cell death. Therefore it raises interest to study substances which are able to interact noncovalently – they are potential anticancer and antiviral agents. This paper is more focused to predicted intercalation of protoberberine alkaloids. Their properties and methods used for structural studies are summarized and effects of individual alkaloids are also compared. The NMR spectroscopy utilized to observe effects of chemical exchange is described. Structural changes cause changes of chemical environment of atoms and this is observable in NMR spectra. Stoichiometry, reaction rate, and equilibrium constant can be determined from chemical shifts and linewidths. That was the aim of practical part of the bachelor thesis. Protoberberine alkaloids palmatine and jatrorrhizine were selected and their bindings to two oligonucleotide duplexes with length of ten bases were investigated in the experimental part of the work. Solutions of these two oligonucleotides were titrated with alkaloid solutions. After each addition NMR spectrum was measured. Fast exchange rate was figured out from the chemical shift evolution and linewidth. The aim was to determine dissociation constant from dependence of the chemical shift on alkaloid concentration. However, fitting of the function of dependence of the dissociation constant on the chemical shift was impossible for several reasons. First, chemical shift evolution was not constant and was affected by some inaccuracies. Second, binding model seems more complicated. There will be effort in the future to avoid the experimental errors. However, the dissociation constant was estimated using the simplest binding model. The results support theory that palmatine is binding to oligonucleotide d(AAGAATTCTT)2 at one plus two equal binding sites. The aim in the future work is to describe the binding model of alkaloids to oligonucleotides more accurately, to eliminate the systematic errors, and to determine the exact dissociation constants and reaction rate constants.

Abstract:

V teoretickej časti bakalárskej práce bolo cieľom priblížiť spôsob väzby malých molekúl na DNA s väčším zameraním sa na nekovalentné interakcie. Tento typ interakcií zabraňuje replikácii a transkripcii DNA a v konečnom dôsledku spôsobuje smrť bunky. To je dôvod, prečo sa stále zvyšuje záujem o štúdium látok, ktoré sú schopné nekovalentných interakcií – majú potenciál pôsobiť ako protirakovinové, či antivirálne prostriedky. Táto práca je bližšie zameraná na predpokladané interkalačné pochody protoberberínových alkaloidov. Zhrnuté sú ich vlastnosti, metódy, ktoré boli k ich štúdiu použité a porovnávané sú tiež účinky medzi jednotlivými zástupcami protoberberínov. Bližšie bola opísaná a aj využitá NMR spektroskopia, pomocou ktorej boli pozorované efekty chemickej výmeny – zmeny v štruktúre látok spôsobujú zmenu chemického okolia atómu a to je pozorovateľné v NMR spektre. Na základe zmien chemického posunu, či pološírok signálov je potom možné určiť stechiometriu viazania sa protoberberínov na DNA, rýchlostné alebo rovnovážne konštanty, čo bolo cieľom praktickej časti bakalárskej práce. Pre bližšie štúdium boli vybraté protoberberínové alkaloidy palmatín a jatrorrhizin. V praktickej časti bola pozorovaná ich väzba na dva oligonukleotidové duplexy o dĺžke desať báz. Roztoky týchto oligonukleotidov boli titrované roztokmi alkaloidov a po každom prídavku bolo zmerané NMR spektrum. Z vývoja chemického posunu a pološírok signálov sa dá usúdiť, že prebiehajúce reakcie sú vzhľadom k NMR spektroskopii mierne rýchle až rýchle. Po vypracovaní grafických závislostí chemických posunov niektorých protónov z oboch alkaloidov a oligonukleotidov, bolo cieľom určiť disociačnú konštantu preložením krivky funkcie vyjadrujúcej závislosť disociačnej konštanty na chemickom posune. Preloženie krivky však nebolo možné, pretože vývoj chemických posunov nebol konštantný a bol ovplyvnený viacerými chybami, ako aj zložitejším modelom väzby alkaloidov na oligonukleotidy. V budúcnosti bude snahou sa týchto chýb vyvarovať. Disociačná konštanta preto bola aspoň odhadnutá pomocou najjednoduchšieho modelu viazania sa dvoch látok. Výsledky podporujú teóriu, že na oligonukleotid so sekvenciou d(AAGAATTCTT)2 sa viaže palmatín na jedno plus dve rovnocenné miesta. V budúcej práci bude cieľom presnejšie objasniť model viazania sa alkaloidov na zvolené oligonukleotidy, eliminovať systematické chyby a získať presné disociačné a rýchlostné konštanty.

Keywords

protoberberínové alkaloidy, palmatín, jatrorrhizin, interkalácie, NMR titrácie, disociačná konštanta

Language used: Slovak

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 5. 2009

Thesis defence

• Date of defence: 15. 6. 2009
• Supervisor: prof. RNDr. Radek Marek, Ph.D.
• Reader: doc. RNDr. Radovan Fiala, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Bachelor programme / field:
Biochemistry / Biochemistry