Stanovení frekvence rekombinací typu SSA u rostlin

Bc. Michal Závodník

Master's thesis

Determination of SSA recombination events in plants

Abstract:

Práce je zaměřena na stabilitu genomu spojenou s procesem sestavování základních jednotek chromatinu - nukleozomů. Jako modelový organismus pro studium frekvence oprav dvouřetězcových zlomů v DNA a dále telomer a jejich jednořetězcových G-přesahů byla vybrána rostlina Arabidopsis thaliana. Telomery jsou nukleoproteinové struktury vyskytující se na koncích lineárních eukaryotických chromozomů. Sekvence telomerové DNA je složena z tandemových repetic. Přítomnost telomer je zcela zásadní, jelikož chrání konce lineárních chromozomů před rozpoznáním DNA opravnými mechanismy. Struktura telomer také reguluje nasednutí enzymu telomerázy, která je schopná telomery prodlužovat. Telomery jsou pro buňky životně důležité. Hrají významnou roli v udržování genomové stability. V souvislosti s tím bylo objeveno, že dochází k jejich zkracování u mutantů v chromatin-sestavujícím faktoru 1 (Chromatin Assembly Factor-1, CAF-1). CAF-1 je evolučně konzervovaný H3 / H4 histonový chaperon složený u A. thaliana ze tří podjednotek – FAS1, FAS2 a MSI1, který je odpovědný za sbalování DNA do nukleozomů při replikaci a opravách. Naše laboratoř již dříve popsala, že CAF1 je zapojen i do replikačních opravných procesů na chromotinu telomer. Cílem této diplomové práce byla příprava speciálních rostlin a následné stanovení frekvence oprav dvouřetězcových zlomů v DNA prostřednictvím systému jednořetězcového nasedání (single strand annealing, SSA) – typem homologní rekombinace. Z tohoto důvodu byly mutantní fas2 rostliny a revertantní rostliny Hrev, u kterých byla obnovena funkční alela pro FAS2, kříženi s rostlinami s vloženým speciálním vektorem DGU_US-1 obsahujícím GUS gen, který kóduje expresi β-glukuronidázy (tzv.markerová linie) a s rostlinami s vloženým genem kódujícím expresi I-SceI restriktázy. Naším současným výsledkem jsou homozygotní rostliny pro jednotlivé konstrukty, které budou kříženy mezi sebou. Výsledkem budou rostliny fas2, Hrev a jako kontrola Col0, obsahující společně jak GUS gen, tak i gen pro I-SceI. Na těchto rostlinách pak bude hodnocena frekvence rekombinace typu SSA. Dále bylo cílem zjistit, jaký mají dopad mutace fas1 a atku70 (v genu kódujícím Ku70 protein) na délku telomer a množství jejich jednořetězcových G-přesahů. Z tohoto důvodu byly použity rostliny křížené v rámci disertační práce Mgr. Veroniky Pavlištové, Ph.D. Mutanty pro gen fas1 byly kříženy s mutanty v genu pro atku70 – kódujícím regulační podjednotku Ku 70 DNA-dependentního protein-kinázového komplexu (DNA-PK), který je zapojen do oprav zlomů v DNA mechanismem nehomologního koncového spojování (NHEJ) a do ochrany telomer. Naše výsledky potvrdily velký vliv mutací jak pro fas1, tak i pro atKu70 na délku telomer a v případě atku70 i výrazný vliv na relativní množství jednořetězcových G-přesahů.

Abstract:

This work is focused on genome stability connected to chromatin assembly process. As a model organism to study the frequency of repair of DNA double-strand breaks, telomeres and their single-strand G-overhangs. Arabidopsis thaliana plant was chosen. Telomeres are nucleoprotein structures at the ends of linear eukaryotic chromosomes. The sekvence of telomeric DNA is composed of tandem repeats. The presence of telomere is essential as it protects the ends of chromosomes from rocognition as damaged DNA by DNA damage repair machineries. The telomere structure also regulates the annealing of the enzyme telomerase, which is able to prolong the telomeres. Telomeres are vitally important for the cells. They play an important role in maintaining of genomic stability and they are considered as one of the stability indicators. In connection with this, it has been discovered that they are severely truncated in mutants in Chromatin assembly factor 1 (CAF-1). CAF-1 is an evolutionarily conserved H3 / H4 histone chaperone consisting in A. thaliana of free subunits – FAS1, FAS2 and MSI1. It is responsible for nucleosome assembly during DNA replication and repair. Our laboratoř has previosly described that CAF-1 is also involved in repair processes of telomeric chromatin. The aim of this thesis was the preparation of specific plants and the subsequent determination of the frequency of DNA double-stranded break repairs in DNA repaired by single strand annealing (SSA) – a type of homologous recombination. For this reason, fas2 mutants and revertant Hrev plants, in which the functional allele for FAS2 was restored, were crossed with plants with inserted special DGU_US-1 vector containing the GUS gene encoding expression of β-glucuronidase (the so-called marker line) and the plants with inserted gene encoding expression of I-Scel restrictase. Our current results represent homozygous plants for each of constructs. These homozygous plants will be mutually crossed. As a result, the fas2, Hrev and Col0 plants will be generated containing GUS gene and gene for I-SceI restrictase. These plants will then be used to assess the SSA frequency. Another aim was to determine the impact of fas1 and atku70 (in the gene coding Ku70 protein) mutations on the telomere lengths and the amount of their single-strand G-overhangs. For this reason, the plants prepared during the dissertation of Mgr. Veronika Pavlištova, Ph.D. were used. Mutants for the fas1 gene were crossed with mutants in the atku70 gene – the gene coding for the regulatory DNA subunit Ku70 of the DNA-dependent protein kinase complex (DNA-PK), which is involved in repairing DNA breaks by non-homologous end-joining mechanism (NHEJ), and in telomere protection. Our results confirmed the large influence of mutations for both fas1 and atku70 on the telomer length as well as a significant effect of mutation in atku70 on relative amount of single-strand G-overhangs.

Keywords

Arabidopsis thaliana, CAF-1, FAS1, FAS2, telomery, jednořetězcová hybridizace, SSA

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 15. 5. 2017

Thesis defence

• Date of defence: 9. 6. 2017
• Supervisor: prof. RNDr. Jiří Fajkus, CSc.

Masaryk University

Faculty of Science

Master programme / field:
Biochemistry / Genomics and Proteomics