Intracelulární distribuce enzymů uvolňujících sulfan ve zrajících oocytech prasete

Veronika Vondráková

Diplomová práce

Intracellular distribution of hydrogen sulfide releasing enzymes in maturing porcine oocytes

Anotace:

Studium molekulárních mechanizmů regulujících reprodukční procesy je nezbytné pro zvyšování efektivnosti reprodukčních biotechnologií, které jsou v chovech zvířat využívány čím dál častěji. Klíčovou součástí mnoha biotechnologických metod je kultivace oocytů, která simuluje přirozené podmínky vaječníků. Tato simulace je ovšem stále nedokonalá a je limitujícím faktorem úspěšnosti vzniku oplození schopných savčích oocytů. Meiotické zrání ovlivňuje mnoho faktorů, mezi které patří například gasotransmiter sulfan (H2S). Donedávna byl sulfan známý pouze jako toxický plyn znečisťující životní prostředí. Dnes víme, že sulfan je za nízkých koncentrací důležitou signální molekulou s nesčetným množstvím fyziologických funkcí. Sulfan je produkován enzymy CBS, CTH a 3-MPST v různých tkáních těla včetně reprodukční soustavy. Na základě dostupných informací byla stanovena hypotéza, že enzymy odpovědné za endogenní produkci sulfanu, CBS, CTH a 3-MPST, jsou přítomné v prasečích oocytech a jejich přítomnost v buněčných organelách se mění během meiotického zrání. Cílem této práce bylo tuto hypotézu ověřit pomocí kultivace prasečích oocytů, imunocytochemické detekce mitochondrií, endoplazmatického retikula a enzymů uvolňujících endogenní sulfan a pomocí kolokalizační analýzy. Vyhodnocením výsledků bylo zjištěno, že enzymy uvolňující sulfan, CBS, CTH a 3-MPST, jsou přítomny v prasečích GV oocytech i v oocytech dozrálých do stádia MII po 48 hod. in vitro kultivaci. Bylo také zjištěno, že během meiotického zrání dochází ke změnám distribuce těchto enzymů v buněčných organelách oocytu. V mitochondriích docházelo k statisticky významným změnám distribuce enzymů 3-MPST a CBS. U enzymu 3-MPST došlo ke vzrůstu hodnot kolokalizačních koeficientů, naopak u enzymu CBS došlo k poklesu těchto hodnot. V endoplazmatickém retikulu docházelo k statisticky významným změnám distribuce všech tří sulfan-uvolňujících enzymů. Hodnoty kolokalizačních koeficientů pro enzymy CBS a 3-MPST vzrostly, naopak pro kombinaci endoplazmatického retikula a CTH klesly. Tyto poznatky jsou důležité pro objasnění role gasotransmiteru sulfanu během meiotického zrání oocytů savců a jejich aplikaci ve šlechtění hospodářských zvířat i asistované reprodukci člověka

Abstract:

The study of the molecular mechanisms regulating reproductive processes is crucial for increasing the efficiency of reproductive biotechnologies that are often used in animal breeding. A key part of many biotechnological methods is the cultivation of oocytes, which simulates natural conditions in the ovaries. However this simulation is still imperfect and presents a limiting factor for successful formation of mammalian oocytes.capable of fertilization. Meiotic maturation is influenced by many factors including for example gasotransmiter hydrogen sulfide (H2S). Until recently, hydrogen sulfide was known only as toxic gas polluting the environment. It was found that the hydrogen sulfide is at low concentrations important signaling molecule with a lot of physiological functions. Hydrogen sulfide is produced by enzymes CBS, CTH and 3-MPST in various tissues of the body, including the reproductive system. We hypothesised that enzymes responsible for the endogenous production of hydrogen sulfide, CBS, CTH and 3-MPST, are present in porcine oocytes and their presence varies during meiotic maturation in cellular organelles. The goal of this study was to prove this hypothesis by cultivating porcine oocytes, detection of mitochondria, endoplasmic reticulum and hydrogen sulfide-releasing enzymes using imunocytochemistry and colocalization analysis. Our results showed that enzymes releasing hydrogen sulfide, CBS, CTH and 3-MPST, are present in GV porcine oocytes and also in the oocytes matured to the MII stage, after 48 hours in vitro cultivation. We found that the distribution of these enzymes in cellular organelles in oocyte changed during meiotic maturation. There were significant changes in the distribution of enzymes 3-MPST and CBS in the mitochondria, levels of colocalization coefficients for enzyme 3-MPST increased, these coefficients for enzyme CBS decreased during meiotic maturation. In endoplasmic reticulum we found significant changes in the distribution of all three hydrogen sulfide-releasing enzymes. Levels of colocalitazion coefficients for CBS and 3-MPST increased, while levels of these coefficients for enzyme CTH decreased. Results of our experiments on porcine oocytes can help to clarify the role of gasotransmitter hydrogen sulfide during meiotic maturaion mammals of oocytes and are highly valueable because their possible application in breeding of farm animals and in human assisted reproduction.

Klíčová slova

oocyt, meiotické zrání, sulfan, CBS, CTH, 3-MPST

Keywords

oocyte, meiotic maturation, hydrogen sulfide, CBS, CTH, 3-MPST

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 7. 4. 2016

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Ing. Kristýna Hošková, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Genové technologie a šlechtění / Reprodukční biotechnologie