Příprava a základní charakterizace fúzních proteinů složených z PDZ3_ZO-1 a GA88

Jan Hurdálek

Master's thesis

The preparation and basic characterization of fusion proteins composed of PDZ3_ZO-1 and GA88

Abstract:

Fúzní proteiny jsou arteficiální proteiny připravované spojením dvou a více proteinových domén, zpravidla pomocí genového inženýrství. Jsou dnes široce uplatňovány v medicíně, vědě i chemickém průmyslu, nicméně nové poznatky o mezidoménovém ovlivňování mají potenciál odvětví designu a přípravy funkčních fúzních proteinů nebývale akcelerovat. Fúzní proteiny představené v této práci, FD5A a FD6A, jsou složeny z PDZ3 domény proteinu ZO 1 a arteficiální chameleonské domény GA88 a molekulárním modelováním in silico u nich byla predikována významná mezidoménová ovlivnění mechanismem dynamické alosterie. FD5A a FD6A s histidinovými kotvami byly v rámci této práce exprimovány v E. coli a purifikovány pomocí afinitní chromatografie s imobilizovanými ionty kovů, dále byly kotvy z proteinů odstraněny pomocí štěpení TEV proteasou a subtraktivní afinitní chromatografie a proteiny byly přečištěny pomocí vylučovaní chromatografie. Následovala charakterizace několika biofyzikálními metodami: analytické vylučovací chromatografie, dynamického rozptylu světla, analytické ultracentrifugace, cirkulárního dichroismu a diferenciální skenovací fluorimetrie. Bylo zjištěno, že ačkoliv se proteiny FD5A a FD6A prakticky neliší terciární ani sekundární strukturou, jejich tepelná stabilita je výrazně odlišná, což poukazuje na vzájemné vzdálené ovlivňování domén v těchto fúzích.

Keywords

proteiny fúzní, proteiny chimérické, domény PDZ, PDZ3 ZO-1, proteiny chameleonské, GA88, alosterie dynamická

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 7. 2023

Thesis defence

• Date of defence: 22. 8. 2023
• Supervisor: doc. RNDr. Lucie Zemanová, Ph.D.
• Reader: PharmDr. Rudolf Andrýs, Ph.D.

University of Hradec Králové

Faculty of Science

Master programme / field:
Chemie / Toxikologie a analýza škodlivin