In vitro produkce embryí u krav

Lucie Bedrníková

Bachelor's thesis

In vitro embryo production in cows

Abstract:

Bakalářská práce je sepsána formou literární rešerše a zabývá se tématem in vitro produkce embryí u krav. Základním krokem k provedení in vitro produkce embryí je odběr oocytů. Odběr oocytů u skotu je možný provádět dvěma způsoby, jedním z nich je odběr oocytů in vivo (z živého zvířete) a druhý je odběr oocytů in vitro (z mrtvého zvířete). Odběr oocytů in vivo je výhodnější díky opakovatelnému odběru a získání velkého množství oocytů. Pro odběr oocytů in vivo se využívá nejčastější transvaginální ultrazvuková punkce, touto metodou se dají oocyty odebírat až 2x týdně. Transvaginální ultrazvuková punkce je prokázána jako velmi úspěšná technika, ve které je dosahováno 60% úspěšnosti. Dále mohou být oocyty odebírány pomocí laparotomie a laparoskopie. Při odběrů in vitro, se oocyty z odebraných vaječníků získají krájením, disekcí, rozřezáváním kůry vaječníku, aspirací a seškrabáváním folikulární stěny. Po zisku oocytů se musí odebrané oocyty nejprve ohodnotit. Dalšími kroky in vitro produkce embryí je IVM (in vitro maturace), IVF (in vitro fertilizace) a IVC (in vitro kultivace). Po odběru jsou oocyty vždy v jádře i cytoplazmě nezralé, proto je nejdříve musíme nechat dozrát ve zracím médiu v přítomnosti hormonů. Nejčastěji se jako zrací médium používá TCM-199 (tkáňové kultivační médium). Zrání oocytů se uskutečňuje buď v mikrokapkách na Petriho miskách, a nebo čtyřjamkových kultivačních miskách krytých olejem v inkubátoru při 39°C s 5% CO2 při 90 % vlhkosti ve vzduchu po dobu 22 aţ 24 hodin. Pro oplození oocytů in vitro je nejčastěji využíváno klasické oplození, ovšem dají se využít i některé mikromanipulační techniky, jako je subzonální fertilizace a intracytoplazmatická injekce spermie. Při klasickém in vitro oplození se oocyty spolu se spermiemi přenesou do oplozovacího média. Pro oplození se musí nejprve připravit spermie, tzn. vyvolá se kapacitace. Oplození trvá 24 hodin a probíhá při teplotě 39°C v 5% atmosféře CO2, někteří autoři ale provádí oplození v atmosféře, která je složena z 90% N2, 5% O2, a 5% CO2 po dobu 22 hodin. Po oplození se dále předpokládané zygoty kultivují in vitro do stádia blastocysty. Embrya ve stádiu blastocysty se ohodnotí a poté se přenesou do příjemkyň nebo se provede kryokonzervace.

Abstract:

This bachelor thesis is written in a form of literary research and the thesis is focused on in vitro embryos production of cows. The first step in performing in vitro embryos production is collecting oocytes. There are two ways to collect cattle oocytes, one is oocytes collection in vivo (the animal is alive) and the second way is oocytes collection in vitro (the animal is dead). In vivo oocytes collection is more efficient thanks to repetitive collection and the possibility of getting a big amount of oocytes. The most popular method used for collecting in vivo oocytes is transvaginal ultrasound puncture, this method allows to get the oocytes collected up to 2 times per week. Transvaginal ultrasound puncture is a very successful technique which reaches up to 60% success rate. The other methods are either a laparotomy or a laparoscopy. Using the in vitro way, the oocytes are collected from the ovaries by slicing, dissection, cutting through the bark of one of the ovaries, aspiration and by scraping of the follicular wall. The collected oocytes must be evaluated. The next steps of in vitro embryos production are IVM (in vitro maturation), IVF (in vitro fertilization) and IVC (in vitro cultivation). The collected oocytes are always unripe in the core and in the cytoplasm, that’s why they need to be put into a hormone medium to ripe. The often used medium is TCM-199 (TissueCulture Medium 199). The maturation of the oocytes usually takes place in microdrops, Petri dish or in an oil covered four-hole container in an incubator with the temperature set to 39°C with 5% CO2 flow and 90% air humidity during 22 to 24 hours. For fertilizing the oocytes using the in vitro method the most often used technique is a classic fertilization, but it is possible to use other micromanipulation techniques such as subzone fertilization and intracytoplasmic sperm injection (ICSI). While using the classic in vitro method the oocytes along with the sperm are transferred into the fertilizing medium. The sperm has to be prepared to fertilize that is, the capacity is raised. The average fertilization time is 24 hours with the temperature set to 39C with 5% CO2 flow, although some authors are performing the fertilization in an atmosphere that is composed of 90% N2 flow, 5% O2 flow and 5% CO2 flow with a total time of 22 hours. After the fertilization are the presumed zygotes cultivated in vitro into the stage of blastocystes. The embryos in the stage of blastocyste are evaluated and then transferred in the receivers or the cryopreservation is performed.

Keywords

reprodukce, oocyt, in vitro oplození, embryo, kráva

Keywords

reproduction, cow, oocyte, in vitro fertilization, embryo

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 4. 2018

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Jiří Šichtař, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Bachelor programme / field:
Animal Science / Animal Science