Cytosine oxidation derivatives, distribution and gene regulation in X and Y Silene latifolia sex chromosomes

Ing. Marcel Hubinský, Ph.D.

Doctoral thesis

Abstract:

Jako konzervovaná epigenetická značka se 5-methylcytosin (5mC) podílí na mnoha důležitých biologických procesech, včetně tvorby heterochromatinu, obrany proti proliferaci transpozonů, genomového imprintingu, regulace exprese endogenních genů a umlčování transgenů. Oxidační produkty 5mC, 5-hydroxymethylcytosin (5hmC), 5-formylcytosin (5fC) a 5-karboxylcytosin (5caC), souhrnně známé jako oxidované methylcytosiny (oxi-mCs), vzbudily značný zájem v oblasti rostlinné epigenetiky. Zatímco výzkum na savcích prokázal klíčové role oxi-mCs v buněčné diferenciaci, karcinogenezi a regulaci genů, jejich funkce v rostlinách zůstávají z velké části neprozkoumané a nejasné. Několik studií na savcích, houbách a rýži ukázalo přímou souvislost mezi 5hmC a různými rodinami transponovatelných elementů (TEs). Tato studie se zaměřuje na dvoudomou rostlinu Silene latifolia, která má heteromorfní pohlavní chromozomy a genom bohatý na TEs, což poskytuje ideální model pro zkoumání oxi-mCs ve vztahu k pohlaví. Pozoruhodným zjištěním této studie byla detekce vysokých úrovní oxi-mCs na genomové úrovni pomocí dvourozměrné ultra výkonné kapalinové chromatografii s tandemovou hmotnostní spektrometrií (2D UPLC-MS/MS), srovnatelných s těmi nalezenými u savců. To je vzácný jev, protože většina pokusů o detekci oxi-mCs v různých rostlinných druzích ukázala minimální nebo žádnou přítomnost oxi-mCs. Dále, imunobarvení interfázních jader a metafázních chromozomů odhalilo, že oxi-mCs jsou přednostně lokalizovány v heterochromatinových lokusech, s výjimkou 5hmC, který vykazoval homogenní distribuci. Zejména X chromozom u samic vykazoval vyšší celkové obohacení o 5hmC a 5fC ve srovnání s jeho protějškem. Toto pozorování koreluje s předchozími nálezy o distribuci 5mC, což naznačuje potenciální roli v dávkové kompenzaci (DC). Analýza kolokalizace signálu protilátek na metafázních chromozomech ukázala silnější korelaci mezi 5mC a 5fC než mezi 5hmC a 5fC, což naznačuje odlišné regulační mechanismy. Kromě toho analýza promotorových oblastí několika pohlavně vázaných genů a oblastí dlouhých terminálních repeticí (LTR) různých rodin retrotranspozonů ukázala jasné pohlavně závislé klastrovaní. Tato zjištění byla odvozena z analýzy kvantitativní polymerázové řetězové reakce (qPCR) imunoprecipitované deoxyribonukleové kyseliny (DNA), což naznačuje potenciální roli oxi-mCs ve vývoji a regulaci pohlavních chromozomů u S. latifolia. Tato práce zdůrazňuje potenciál oxi-mCs jako nových epigenetických značek v rostlinách, které by neměly být přehlíženy, a otevírá nové cesty pro pochopení jejich rolí ve vývoji rostlin a regulaci genomu.

Abstract:

Being a conserved epigenetic mark, 5-methylcytosine (5mC) is involved in many important biological processes, including heterochromatin formation, defence against transposon proliferation, genomic imprinting, regulation of endogenous gene expression and silencing of transgenes. The oxidation products of 5mC: 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC), and 5-carboxylcytosine (5caC), collectively known as oxidized methylcytosines (oxi-mCs), have garnered significant interest in the field of plant epigenetics. While research in mammals has demonstrated key roles of oxi-mCs in cellular differentiation, carcinogenesis, and gene regulation, their functions in plants remain largely unexplored and unclear. Several studies in mammals, fungi, and rice have shown a direct association between 5-hmC and various families of transposable elements (TE). This study focuses on the dioecious plant Silene latifolia, which has heteromorphic sex chromosomes and a TE-rich genome, providing an ideal model for examining oxi-mCs in relation to sex chromosome evolution. A remarkable finding in this study was the detection through two-dimensional ultraperformance liquid chromatography tandem mass spectrometry (2D UPLC-MS/MS) of high levels of oxi-mCs at the genomic level, comparable to those found in mammals. This is a rare phenomenon, as most attempts to detect oxi-mCs in various plant species have shown minimal or no presence of oxi-mCs. Furthermore, immunostaining of interphase nuclei and metaphasic chromosomes revealed that oxi-mCs are preferentially localized in heterochromatic loci, except for 5hmC, which displayed a homogeneous distribution. Notably, the X chromosome in females exhibited higher overall enrichment of 5hmC and 5fC compared to its counterpart. This observation correlates with previous findings on the distribution of 5mC, suggesting a potential role in dosage compensation (DC). Colocalization analysis of antibody signal on metaphase chromosomes showed a stronger correlation between 5mC and 5fC than between 5hmC and 5fC, indicating distinct regulatory mechanisms. Additionally, analysis of promoter regions of several sex-linked genes and long terminal repeat (LTR) regions of various retrotransposon families showed clear sex-dependent clustering. These findings were derived from quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis of immunoprecipitated deoxyribonucleic acid (DNA), suggesting a potential role for oxi-mCs in the development and regulation of sex chromosomes in S. latifolia. This work highlights the potential of oxi-mCs as novel epigenetic marks in plants that should not be overlooked, opening new avenues for understanding their role in plant development and genome regulation.

Keywords

Silene latifolia, Epigenetics, Sex-chromosomes, Methylation, Cytosine oxidation derivatives, Transposable elements, Dosage compensation

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 16. 8. 2024

Thesis defence

• Date of defence: 3. 9. 2024
• Supervisor: Ph.D. José Luís Rodríguez Lorenzo
• Reader: RNDr. Terezie Malík Mandáková, Ph.D., prof. Ing. Petr Smýkal, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Genomics and Proteomics / Genomics and Proteomics