Využití MALDI biotypingu pro identifikaci plísňových škůdců rostlinné zemědělské produkce

Bc. Karolína Novotná

Diplomová práce

Application of MALDI biotyping for identification of agricultural crop production mold pathogens

Anotace:

MALDI-TOF MS je poměrně mladá metoda, která se v laboratorní praxi neustále rozvíjí. Na rozdíl od identifikace bakterií a kvasinek je její využití pro identifikaci vláknitých oomycet poněkud náročnější. Jedná se především o fázi přípravy vzorků, kultivaci v tekutém živném médiu, které za neustálého třepání trvá zhruba podle druhu 3–5 dní a následné zpracování (extrakce etanolem, nanesení na destičku a měření hmotnostním spektrometrem) několik hodin. Přesto je tato metoda identifikace těchto organismů mnohem rychlejší a méně nákladná než ostatní postupy zmíněné v přehledu literatury. Přes nesporné výhody MALDI-TOF MS mohou nastat situace, kdy bývá identifikace neúspěšná. Nelze tedy opomenout důležitost kroků před samotnou identifikací, zvláště při tvorbě referenční databáze, kdy je nezbytná maximální přesnost. Prvním z nich je izolace vzorku ve správném období. U rodu Phytophthora se jedná o teplejší měsíce v roce, konkrétně od května do listopadu. Odběr vzorků je možný z kořenů nebo z nadzemních částí rostliny. Během kultivace kmene v tekutém médiu je velmi důležité dodržovat podmínky optimální pro předpokládanou skupinu vláknitých oomycet a zároveň je třeba udržovat kulturu v neustálém pohybu. Nedefinovaný nárůst kmene v živném médiu snižuje kvalitu výsledného spektra, a tudíž i kvalitu výsledné identifikace. Příprava vzorku před vlastním zpracováním je další velmi důležitou fází, proto je zásadním faktorem správný výběr extrakční metody. Dále pak mohou vzniknout chyby při nanášení vzorku na spot, které jsou většinou způsobené nanesením nehomogenní vrstvy spojené s tvorbou velkých krystalů. Pro získání spolehlivých výsledků je dalším nezbytným krokem test přesnosti a správnosti metody. K tomu bylo v této práci použito několik způsobů, a to měření slepého vzorku, porovnání hmotnostních spekter rodu Phytophthora se spektry uloženými ve specifické databázi a zjištění rozdílu mezi spektry v rámci rodu a mezi jednotlivými druhy i kmeny.

Abstract:

MALDI-TOF MS is a relatively young method that is constantly developing in laboratory practice. Unlike the identification of bacteria and yeasts, the use this method for fibrous oomycetes is a bit more demanding. This is mainly the stage of preparation of samples, cultivation in liquid nutrient medium, which takes about 3 to 5 days depending on the type of shaking and subsequent processing (ethanol extraction, plate application and mass spectrometry) for several hours. However, this method of identification of fungal organisms is much faster than the other methods mentioned in the literature review. Despite the unquestionable advantages of MALDI-TOF MS, there may be situations where identification is unsuccessful. Therefore, we must not forget the importance of the steps before identifying itself, especially when creating a reference database where maximal accuracy is ensured. The first is to isolate the sample at the right time. The Phytophthora need warmer months in the year, specifically from May to November. Sampling is possible from the roots or directly from the plant tissue. During the cultivation of the strain in the liquid medium, it is very important to adhere to the conditions optimal for the supposed group of fibrous oomycetes, and it is also necessary to keep the pattern in constant movement. Undefined strain growth in the nutrient medium reduces the quality of the resulting spectrum and hence the quality of the resulting identification. Preparing a sample before processing it is another crucial point of the identification, thus the correct selection of the extraction method can not be passed. Additionally, mistakes resulting from the application of a sample to the target, which are mostly caused by the application of a non-homogeneous layer connected with the formation of large crystals. For success, the next step is to test the accuracy and precision of the method. For the evaluation, the following methods have been used: measuring a blank sample, comparing Phytophthora mass spectra with specimens saved in a specific database and finding the differences between spectra within the genus and between species and strains.

Klíčová slova

biotyping, MALDI, houby, škůdci, klasifikace

Keywords

biotyping, MALDI, fungi, pests, classific

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 11. 4. 2019

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: Mgr. Petr Maršík, Ph.D.

Česká zemědělská univerzita v Praze

Fakulta agrobiologie, potravinových a přírodních zdrojů

Magisterský studijní program / obor:
Kvalita a zpracování zemědělských produktů / Kvalita a zpracování zemědělských produktů