Inženýrství Pseudomonas putida pro ko-utilizaci a zužitkování celobiózy s glukózou

Bc. Dalimil Bujdoš

Diplomová práce

Engineering Pseudomonas putida for co-utilisation and valorization of cellobiose with glucose

Anotace:

Lignocelulóza je rozšířený, levný a obnovitelný zdroj uhlíku, a může proto sloužit jako náhrada za fosilní paliva, která způsobují zátěž pro životní prostředí. Mezi důvody, proč se lignocelulóza stále masivně nepoužívá v bioprůmyslu, patří její komplexní monomerní složení a omezení vyplývající z mikrobiální přeměny monomerů a oligomerů na produkty. V předchozí práci byl zaveden metabolismus celobiózy v biotechnologicky relevantní bakterii Pseudomonas putida. Rekombinantní kmen s beta-glukosidázou (BglC) z Thermobifida fusca však vykazoval diauxický růst, když byl kultivován na směsi glukózy a celobiózy. V této studii jsme se tímto problémem zabývali. Nejprve jsme prokázali, že D-glukono-delta-lakton produkovaný v periplazmě z glukózy enzymem glukóza dehydrogenázou (Gcd) inhibuje enzym BglC a je zodpovědný za pozorovanou diauxii. Delece gcd odstranila diauxický růst, ale také významně snížila rychlost růstu mutanta na glukóze. Korekční strategie zahrnovala expresi genu pro transport glukózy: glf z Zymomonas mobilis a genu pro transport laktózy lacY z Escherichia coli v P. putida ∆gcd. Tyto modifikace zvýšily rychlost růstu glukózy téměř na úroveň divokého typu a také zlepšily utilizaci celobiózy. Pomocí metod výpočetní biologie byl sestaven matematický model zahrnující proteomická a kinetická data. S využitím tohoto modelu jsme dále charakterizovali naše kmeny a navrhli vysvětlení pozorovaných experimentálních výsledků.

Abstract:

Lignocellulose is an abundant, cheap, and renewable source of carbon and can therefore serve as a substitute for fossil fuels that cause an increasing environmental burden. Among the reasons why lignocellulose is still not massively used in bioindustry are its complex monomeric composition, and the limitations that stem from the microbial conversion of monomers and oligomers into products. In a previous work cellobiose metabolism was established in the biotechnologically relevant bacterium Pseudomonas putida. However, the recombinant strain with beta-glucosidase (BglC) from Thermobifida fusca showed diauxic behavior when grown on a mixture of glucose and cellobiose. In this study, we tackled this issue. First, we proved that D-glucono-delta-lactone produced in the periplasm from glucose by glucose dehydrogenase (Gcd) inhibits enzyme BglC and is responsible for the observed diauxia. The deletion of gcd removed the diauxic growth but also significantly reduced the growth rate of the mutant on glucose. The correction strategy included expression of glucose facilitator gene glf from Zymomonas mobilis and lactose transporter gene lacY from Escherichia coli in P. putida ∆gcd. These modifications increased the growth rate on glucose almost to the level of the wild type strain and also improved the utilization of cellobiose. Using the methods of computational biology, a mathematical model encompassing proteomic and kinetic data were constructed. With the use of this model, we further characterized our strains and proposed an explanation of the observed experimental results.

Keywords

Lignocelulóza, Pseudomonas putida, Metabolické inženýrství, Metabolické modelování, Ko-utilizace, Lignocellulose, Metabolic engineering, Metabolic modelling

Jazyk práce: angličtina

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 17. 6. 2021

Obhajoba závěrečné práce

• Obhajoba proběhla 13. 7. 2021
• Vedoucí: Mgr. Pavel Dvořák, Ph.D.
• Oponent: Ing. RNDr. Martin Marek, Ph.D.

Masarykova univerzita

Přírodovědecká fakulta

Magisterský studijní program / obor:
Mikrobiologie / Mikrobiologie