In vitro produkce embryí u koní

Dominika Babická

Bachelor's thesis

In vitro embryo production in horses

Abstract:

Cílem této práce je napsat literární rešerši zahrnující nejnovější poznatky z oblasti in vitro produkce embryí u koní. Aby bylo možné provést in vitro produkci embryí, je potřeba nejprve znát anatomii klisny a řízení pohlavní aktivity. Pohlavní soustava klisny se skládá ze dvou vaječníků, dvou vejcovodů, dělohy, pochvy a vulvy. Na rozdíl od jiných hospodářských zvířat probíhá vývoj oocytů v dřeni vaječníků. Pohlavní aktivita je řízena neurohumorálně a produkci hormonů zajišťuje centrální nervová soustava a endokrinní žlázy. Pro in vitro produkci embryí se musí nejprve získat oocyty. Ty se sbírají buď z živých, nebo mrtvých klisen. U živých klisen se využívá ovum pick up (OPU, transvaginální aspirace oocytů pomocí ultrazvuku), laparotomie přes slabinu, nebo transkutánní punkce přes slabinu. Neinvazivní metodou je OPU, kdy se každý folikul několikrát vyplachuje, a v získaném roztoku se hledají oocyty. Invazivní, za to však úspěšnější metodou při získání oocytů, je transkutánní punkce přes slabinu. Z vaječníků z jatek se oocyty sbírají rozřezáním vaječníků, kyretáží, nebo aspirací. Velmi dobré výsledky v množství zíkaných oocytů má rozřezání vaječníků. Po sesbírání se oocyty nejprve musí roztřídit podle kvality kumulo-oocytárního komplexu na oocyty kompaktní, expandované, nebo degenerující. Kompaktní a expandované oocyty se rozlišují pod mikroskopem na základě morfologie okrajů těchto komplexů. Kompaktní oocyty mají čistou linii okraje, zatímco expandované oocyty mají okraje zdeformované a mají heterogenní cytoplazmu. Nejlepší výsledky pro produkci embryí vykazují expandované oocyty. Ty se nejprve musí nechat zrát v kultivačním médiu do stádia MII. Kultivační systém pro zrání oocytů se sestává z použití M199 s Earlovou solí, 10% fetálního bovinního séra a 5 mU - ml bovinního folikulostimulačního hormonu ve zvlhčené atmosféře 5% CO2 ve vzduchu při 38,2°C. Bylo zjištěno, že nezáleží na délce kultivace, výsledky vývoje blastocyst po 24 nebo 48 hodinách byly stejné. Standardní IVF se u koní nedá provést kvůli změnám na zoně pellucidě a problematické kapacitaci spermií. Proto se používá intracytoplazmatická injekce spermie (ICSI), kdy se přímo do oocytu injikuje jedna znehybněná spermie. Před ICSI musí proběhnout kapacitace spermie pomocí kalcium ionoforu. Oocyt se dále kultivuje in vitro do stádia blastocysty. Další možností je přenos oplozeného oocytu přímo do děložního rohu klisny, nebo se uchovává pomocí kryokonzervace pro další použití.

Abstract:

The aim of this work is to write a literature review covering the latest findings in the field of in vitro embryo production in horses. In order to perform in vitro embryo production, you first need to know the anatomy of a mare and management of sexual activity. Reproductive systém of mares consists of two ovaries, two oviducts, uterus, vagina and vulva. Unlike other livestock, the development of oocytes is in the cortex of the ovary. Sexual activity is driven neurohumoral and production of hormone is ensured by the central nervous system and endocrine glands. For in vitro embryo production must be obtained first oocytes. These are collected from either the living or the dead mares. For live mares are used ovum pick up (OPU, transvaginal ultrasound guided aspiration), standing flank laparotomy or transcutaneous flank puncture. OPU is a noninvasive method, where each follicle is flushed several times, and in the obtained solution is looked for oocytes. Invasive, but a very successful method for obtaining oocytes is transcutaneous flank puncture. There are three ways for collecting oocytes from abbatoir ovaries - either by slicing ovaries or curettage or aspiration. Very good results in amounts of obtained oocytes was proved by slicing ovaries. First, after collecting oocytes must be sorted according to cumulus-oocyte complex (COC) on compact, expanded or degenerating oocytes. Compact and expanded oocytes are distinguished under a microscope based on the morphology of the edges of this COC. Compact oocytes have a clear line margins, while margins of expanded oocytes are deformed and have heterogeneous cytoplasm. Best results for the production of embryos exhibit expanded oocytes. First, it has to be matured in the medium to the stage of MII. The culture system for oocyte maturation consists of the M199 with Earl's salts, 10% fetal bovine serum and 5 mU - ml of bovine follicle stimulating hormone in a humidified atmosphere of 5% CO2 in air at 38.2 ° C. It was found out that regardless of the duration of cultivation, results of development of blastocysts after 24 or 48 hours were the same. Standard IVF in horses can not be performed due to the zona pellucida and sperm capacitation. Therefore it is used intracytoplasmic sperm injection (ICSI), when one immobilized sperm is injected directly into the oocyte. Before ICSI sperm capacitation must be done by using the calcium ionophore. Oocytes were further cultured in vitro to the blastocyst stage. Another possibility is to transfer the fertilized oocyte directly to the uterine horn of the mare, or it is used cryopreservation for future.

Keywords

kůň, reprodukce, embryo, in vitro, ICSI

Keywords

reproduction, embryo, in vitro, ICSI, horse

Language used: Czech

Date on which the thesis was submitted / produced: 14. 4. 2016

Thesis defence

• Supervisor: Ing. Jiří Šichtař, Ph.D.

Czech University of Life Sciences Prague

Faculty of Agrobiology, Food and Natural Resources

Bachelor programme / field:
Animal Science / Horse Breeding