Strukturní a funkční plasticita thylakoidních membrán. Role polymorfismu lipidů

Mgr. Ondřej DLOUHÝ

Doctoral thesis

Structural and functional plasticity of thylakoid membranes. Role of lipid polymorphism

Abstract:

Naše znalosti struktury a funkce tylakoidních membrán (TM) chloroplastů vyšších rostlin jsou detailní a široce přijímané, nicméně některé zásadní otázky zůstávají stále nezodpovězeny. Energizovaný stav TM je podmíněn její organizací do lipidové dvouvrstvy, přesto je TM tvořena zhruba z 50 % molekulami monogalaktosyldiacylglycerolu (MGDG), který se řadí mezi lipidy, které lipidovou dvouvrstvu nevytváří. Na modelových systémech bylo ukázáno, že aktivita violaxantin deepoxidázy (VDE) - hydrofilního enzymu s fotoprotektivní úlohou, nacházejícího se v lumenu TM - závisí na přítomnosti nedvouvrstevné lipidové fáze. Pomocí 31P-NMR spektroskopie byla v izolovaných a plně funkčních TM špenátu prokázána přítomnost nejen lipidové dvouvrstvy, ale také několika nedvouvrstevných fází. Předpokládá se, že nedvouvrstevné lipidové fáze přispívají k strukturní plasticitě TM a dopomáhají udržovat jejich vysoký poměr proteinů k lipidům. Nicméně úloha, kterou mají nedvouvrstevné lipidové fáze ve struktuře a funkci TM není doposud zcela objasněna V této dizertační práci se zaměřuji na tři hlavní oblasti: (1) základní vlastnosti polymorfismu lipidů v isolovaných rostlinných TM, (2) strukturní entity zodpovědné za vznik různých lipidových fází a (3) jejich fyziologické úlohy. Pro zodpovězení těchto otázek jsme využili metodu 31P-NMR s matematickou dekonvolucí získaných spekter na TM izolovaných z rostlin špenátu, hrachu, smrku a huseníčku, spekter granálních a stromálních TM izolovaných ze špenátu a také izolovaných plastoglobulinů a experimenty saturačního prepulzu. Polymorfismus lipidů TM byl modulován především změnami podmínek prostředí (fyzikálně-chemické vlastnosti), a také působením lipáz a proteáz. Struktura, makro-organizace proteinových komplexů a fotochemická aktivita TM byla charakterizována pomocí optické spektroskopie a biochemickými metodami. Ultrastruktura izolovaných částic TM byla studována pomocí elektronové mikroskopie a rozptylu rentgenových paprsků pod malým úhlem. (1.1) Prokázali jsme, že polymorfismus lipidů různých druhů vyšších rostlin je velmi podobný; (1.2) pomocí matematické dekonvoluce bylo zjištěno, že pouze asi 37 ? 7 % lipidů TM špenátu se vyskytuje ve formě lipidové dvouvrstvy, 42 ? 10 % v nedvouvrstevné hexagonální (HII) fázi, a 15, 3 a 2 % se nachází v izotropních fázích (n = 14); a (1.3) distribuce spektrálních komponentů, které byly použity pro dekonvoluci byly potvrzeny aplikací saturačního prepulzu. Prokázali jsme, že (2.1) příspěvek plastoglobulinů k polymorfismu lipidů izolovaných TM je zanedbatelný; (2.2) polymorfismus lipidů izolovaných granálních a stromálních TM je téměř identický jako u intaktních TM; (2.3) VDE se vyskytuje v granálních i stromálních TM; (2.4) nedvouvrstevné lipidové fáze se nachází v oblastech membrán chudých na výskyt proteinů - tj. tam kde se nevyskytují pigment proteinové komplexy; (2.5) konkrétně izotropní fáze se vyskytují v místech, kde se membrány propojují/ fúzují, ale také ve strukturách vznikajících asociací lipidů a VDE anebo jiným lipokalinem (jak už bylo ukázáno dříve). HII fáze pravděpodobně vzniká z lipidů obklopujících stromální proteiny anebo polypeptidy. V kontextu fyziologických funkcí a dynamiky lipidových fází TM (3.1) jsme prokázali, že změny indukované teplotou a pH jsou do značné míry vratné: nízké pH a zvýšená teplota vyvolaly vyšší zastoupení izotropní fáze a zrychlily relaxaci protonmotivní síly; (3.2) vyšší výskyt izotropních fází koreloval s aktivitou VDE - enzymem xantofylového cyklu, který je aktivovaný nízkým pH; a také s (3.3) fotoprotektivím nefotochemickým zhášením singletního excitovaného stavu chlorofylu a. Získaná data

Abstract:

Our knowledge about the structure and function of thylakoid membranes (TMs) of higher plant chloroplasts is well established, but some important research areas remain to be explored. Albeit the energization of TMs relies on its bilayer organization, about half of the TM lipids are monogalactosyldiacylglycerol (MGDG) molecules, which are non-lamellar lipids. It is known that, in model systems, the activity of the water-soluble photoprotective violaxanthin de-epoxidase (VDE), TM luminal enzyme, depends on the presence of a non-lamellar phase. Using 31P-NMR spectroscopy, it has also been shown that isolated fully functional spinach TMs contain, in addition to the lamellar phase, three non-lamellar lipid phases. It was proposed that these non-lamellar phases contribute to the structural plasticity of TMs and safe-guard their high protein-to-lipid ratio. However, numerous questions remained to be answered about the structural and functional roles of the non-lamellar lipid phases in TMs. In this thesis I was focused on: (1) general properties of the polymorphic phase behavior of isolated plant TMs, (2) structural entities responsible for the origin of different lipid phases and (3) their physiological significance. To elucidate these questions, we performed 31P-NMR spectroscopy on isolated TMs from spinach, pea, spruce and Arabidopsis thaliana, and granum and stroma sub-chloroplast membrane particles isolated from spinach, as well as isolated plastoglobuli; applied mathematical deconvolution and carried out saturation transfer experiments. The lipid polymorphism of TMs was modulated mainly by varying their physiological state and physico-chemical environments, and by applying lipases and proteinases. The molecular organization and the photochemical activity of TMs were characterized by using optical spectroscopy techniques and biochemical and analytical tools; the ultrastructure of different preparations was portrayed by electron microscopy techniques and small-angle X-ray scattering. We (1.1) established that the phase behavior of different higher plant TMs largely resemble to each other; (1.2) provided a mathematical deconvolution of the 31P-NMR spectra, which on spinach TMs revealed that only about 37 ? 7 % of the bulk lipid molecules are found in the lamellar phase, and the non lamellar phases HII and different isotropic phases are represented by 42 ? 10 % and about 15, 3 and 2 %, respectively (n = 14); and (1.3) the spectral distributions, used for the mathematical deconvolution, were confirmed by saturation transfer experiments. We have shown that (2.1) contribution of plastoglobuli to the lipid polymorphism of isolated TMs is negligible; (2.2) the lipid polymorphisms of isolated granum and stroma TMs are almost identical with that in intact TMs; (2.3) VDE is present in these sub chloroplast preparations; (2.4) the non lamellar lipid phases are to be found outside the protein rich areas which contain the photosynthetic pigment protein complexes; (2.5) in particular, the isotropic phases are proposed to originate from membrane fusions and junctions as well as from the association of lipid molecules with VDE and/or with other lipocalins, in accordance with earlier tentative assignments, and the HII phase may originate from lipids encapsulating stroma side proteins or polypeptides. Regarding the physiological significance and dynamics of the lipid phase behavior of TMs (3.1) we have demonstrated that the temperature- and pH induced changes are largely reversible: low pH and elevated temperatures have been shown to enhance the isotropic phases and to accelerate the relaxation of the proton-motive force; nevertheless, (3.2) the enhancement of the isotropic phases has turned out to be correlated with the activity of VDE, the low luminal pH activated enzyme of the xanthophyll cycle; as well as (3.3) with the photoprotective mechanism of non photochemical quenching (NPQ) of the singlet excited state of chlorophyll a.

Abstract:

lze interpretovat v rámci modelu TM "Dynamic Exchange Model", který je založen na koexistenci různých lipidových fází a jejich dynamické rovnováhy, reagující na změny fyzikálně-chemického prostředí TM a fyziologických procesů v chloroplastu.

Keywords

31P-NMR spektroskopie, elektronová mikroskopie, polymorfismus lipidů, optická spektroskopie, fotoprotekce, protonmotivní síla, tylakoidní membrány

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 20. 12. 2022

Accessible from:: 31. 12. 2999

Thesis defence

• Supervisor: Dr. Gyözö Garab, Dr. Gyözö Garab

University of Ostrava

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Applied Physics / Biofyzika