The role of RING finger proteins in Wnt signalling

Tomasz Witold Radaszkiewicz, M.Sc.

Doctoral thesis

Abstract:

Wnt signální dráhy představují komplikovaný systém interakcí, které řídí různé funkce mnohobuněčných organismů. Úsilí vědecké komunity po celém světě vedlo k objevení základních mechanismů, ale mnoho dalších zůstává zatím stále neprobádaných. Patří k nim například řídící uzly mezi jednotlivými Wnt drahami a důsledky jejich aktivace, a proto jsem se v mé práci zaměřil na protein RNF43. RNF43 je E3-ubikvitin ligáza z enzymatické rodiny PA-TM-RING. RNF43 a jeho homolog ZNRF3 jsou podrobně studovány kvůli jejich uplatnění v udržení homeostázy a vzniku onemocnění. Hlavní funkcí RNF43/ZNRF3 v kontextu Wnt signalizace je negativní regulace množství receptorů Frizzled a koreceptorů LRP5/6 na povrchu buňky. Doposud nebylo jasné, zda extracelulární Protease Associated (PA) doména proteinu RNF43 je nezbytná pro jeho působení v lidském organismu. Z tohoto důvodu jsme se rozhodli detailně prostudovat vliv PA na funkci RNF43 proteinu. Pomocí aplikovaným metod jsem dokázali, že tato doména není nezbytná k inhibici kanonické Wnt signalizace zprostředkované RNF43. Předchozí práce naznačují možné zapojení RNF43 v další větvi Wnt signalizace zvané nekanonická Wnt dráha. Proto jsme se zaměřili na úlohu RNF43 v této dráze a sledovali jsme, zda se liší od kanonické větve. Abychom získali odpověď na tyto otázky, využili jsme metodu pro studium protein-proteinových interakcí, která je založena na označení proteinů v blízkosti proteinu zájmu biotinem. Naše poznatky jsme dále ověřili na buněčných modelech. Zapojení nekanonické Wnt dráhy je také zmiňováno v souvislosti s progresí nádorů a vzniku rezistence k cílené terapii melanomu a proto jsme testovali vliv působení RNF43 na buňky melanomu in vitro a in vivo. Kromě toho jsme také popsali nový mechanizmus RNF43 aktivace zprostředkovaný fosforylací CK1α a nečekané onkogenické vlastnosti zkrácené varianty RNF43, která se objevuje u nádorových buněk různého původu. Výsledky získané během mého studia poskytují nový a komplexní pohled na mechanizmy RNF43 působící v lidských buňkách. Ustanovili jsme nové in vitro a in vivo modely, které mohou být využity v následných studiích této problematiky.

Abstract:

Wnt signalling pathway is a complicated system of interactions, which controls the various aspects of multicellular organism biology. Efforts of the scientific community worldwide lead to the description of its general action mechanism. Nevertheless, there is still blank space left and we need to understand better i.e. regulation points within multiple Wnt pathways and outcomes of their activity. Thus, in my work I investigated the protein called RNF43. RNF43 is E3 ubiquitin ligase from the PA-TM-RING enzymatic family. RNF43 and its homolog ZNRF3 are being extensively studied because of their role in the various aspects of homeostasis and disease. The main function of RNF43/ZNRF3 in Wnt pathway is the negative regulation of the surface level of Wnt receptors Frizzleds and LRP5/6 co-receptors. Importantly, it is currently unclear whether extracellular Protease Associated domain of RNF43 is required for its action in human cells. This fact encouraged us to investigate in detail the role of PA fold in the RNF43 function. Thanks to applied approaches, we were able to demonstrate that this domain is not essential for the RNF43-mediated inhibition of the canonical Wnt signalling pathway. Next, the existing data suggest that RNF43 can be also involved in the other branch of Wnt pathway, called the noncanonical Wnt signalling. We were intrigued to ask if RNF43 can modulate it by specific mechanism, different than the one dedicated for the canonical axis. To address this question, we utilized proximity-dependent biotin identification method for protein-protein interactions detection. In the next step, we verified our key findings using cellular models. Further, noncanonical Wnt signalling is known to drive cancer progression and targeted therapy resistance in melanoma. Hence, we tested the impact of RNF43 action on the several aspects of melanoma cell properties in vitro and in vivo. Lastly, we described the new mechanism of RNF43 activation by CK1α-mediated phosphorylation and unexpected oncogenic properties of RNF43 truncated variant occurring in various cancer types. Results gathered during my studies provide novel and comprehensive insights into the RNF43 mechanistic mode of action in human cells. We established new in-vitro and in-vivo models which can be utilised in the follow-up studies.

Keywords

RNF43, ZNRF3, WNT5A, melanoma, targeted therapy, PCP, VANGL1, VANGL2, dishevelled

Language used: English

Date on which the thesis was submitted / produced: 5. 8. 2020

Thesis defence

• Date of defence: 31. 8. 2020
• Supervisor: prof. Mgr. Vítězslav Bryja, Ph.D.
• Reader: doc. RNDr. Jan Brábek, Ph.D., Bon-Kyoung Koo, Ph.D.

Masaryk University

Faculty of Science

Doctoral programme / field:
Animal physiology, immunology and developmental biology / Animal physiology, immunology and developmental biology