Využití materiálů na bázi TiO\dindex{2} pro izolaci a purifikaci molekul RNA

Bc. Denisa Smělá

Diplomová práce

Application of TiO2-based materials for isolation and purification of RNA molecules

Anotace:

Diplomová práce je zaměřena na zavedení metody izolace a purifikace krátkých molekul RNA pomocí materiálů na bázi TiO2 s následnou detekcí pomocí hmotnostní spektrometrie. Podmínky izolace oligo RNA byly testovány a optimalizovány na TiO2 mikročásticích (Titansphere) a na magnetických nanotrubičkách (TiO2NTs@Fe3O4NPs). Výchozím biologickým materiálem byly T- a B-lymfatické nádorové buněčné linie JURKAT a RAJI. Bylo zjištěno, že pomocí TiO2 mikročástic lze ve vhodně zvolených podmínkách izolovat nukleové kyseliny a současně oddělit krátké molekuly RNA od dlouhých. Součástí práce bylo také zavedení komerčně dostupných technik izolace RNA a jejich porovnání s nově vyvíjeným postupem. Byla provedena optimalizace metody průkazu a identifikace krátkých RNA metodou elektroforetické separace na polyakrylamidovém gelu s močovinou. Byly zjištěny podmínky separace: 20% polyakrylamidový gel s 8M močovinou a barvení SYBRTM Green II. V neposlední řadě jsme se v této práci zaměřili na možnost průkazu a analýzy krátkých RNA pomocí hmotnostní spektrometrie. Pro optimalizaci preanalytické fáze byl sestaven panel matric, ze kterých byly vybrány matrice s vhodnými vlastnostmi pro následnou ionizaci sledovaných biomolekul.

Abstract:

This thesis deals with the application of TiO2-based materials for isolation and purification of short RNA molecules with mass spectrometry used for its detection afterwards. Process of oligo RNA isolation has been tested for TiO2 microparticles (Titansphere) and magnetic nanotubes (TiO2NTs@Fe3O4NPs). Immortalized lines of human T- and B-lymphocyte cells were used as the source material. Nucleic acids can be isolated and short RNA molecules can be separated from longer ones by TiO2 microparticles in suitable conditions. Important part of this work was also implementation of comercialy available kits and comparison of their relative quantification with the newly developed method. To ensure quality detection of isolated RNA, the optimalization of electrophoretic separation using polyacrylamide gel with urea for the short RNAs analysis was done. The best conditions are: 20% polyacrylamide gel with 8M urea, died with SYBRTM Green II. Last, but not least, we focused on short RNA detection using mass spectrometry. We choose several matrix suitable for RNA analysis from the list of chemicals prepared for preanalytical phase optimalization.

Klíčová slova

miRNA, oligo RNA, TiO2, extrakce na pevné fázi, diskontinuální elektroforéza, hmotnostní spektrometrie

Jazyk práce: čeština

Datum vytvoření / odevzdání či podání práce: 10. 5. 2018

Zveřejnit od: 31. 12. 2999

Obhajoba závěrečné práce

• Vedoucí: prof. RNDr. Zuzana Bílková, Ph.D.

Univerzita Pardubice

Fakulta chemicko-technologická

Magisterský studijní program / obor:
Speciální chemicko-biologické obory / Bioanalytik